基因工程的酶学基础

是带3’-OH的RNA或DNA 短链；

RNaseH活性： 5 ´ →3 ´ 或3 ´ →5 ´ 方向特异地降解
RNA-DNA杂交分子中的RNA链。

已从多种RNA肿瘤病毒中分离到反转录酶，商品
化酶有来源于禽骨髓母细胞瘤病毒（AMV)和鼠白
血病病毒(M-MLV)的逆转录酶。二者在RNaseH活 性、最适反应温度及pH等有差异。
3.4 核酸修饰酶

除前述的一些酶外，还使用一些修饰酶对
核酸分子进行修饰，如用末端转移酶进行
同聚物加尾，用碱性磷酸酶切除DNA5’端
磷酸基团，防止载体自身环化等。
3.4.1 末端（脱氧核苷酸）转移酶

从小牛胸腺中纯化，能够催化 dNTP进行
5′→ 3′方向的聚合作用，逐个将脱氧核苷酸
分子加到线性DNA分子的3′-OH末端。主
1、DNA接头连接法
接头是人工合成包含某一限制酶切位点的短寡核苷酸， 本身已是粘性末端。
2、衔（连）接物连接法
衔（连）接物是人工合成包含 某一限制酶切位点的短寡双链 核苷酸。
3、同聚物加尾法

利用末端转移 酶，在平端 DNA分子的3´ 端加一串相同 核苷酸组成的 粘性末端。
3.3 DNA聚合酶
反应条件：
低水平Zn2+、最适pH值4.0~4.3、NaCl浓度 100mmol/L
要的应用是同聚物加尾。

不需模板，但底物至少是3个核苷酸以上的
片段，底物单链双链都可以。
例：用同 聚物加尾 法再生 HindIII识 别位点
3.4.2 T4多核苷酸激酶与DNA分子5′-末端标记

T4噬菌体基因编码，正向反应催化γ-磷酸从ATP 分子转移给DNA或RNA分子的5′-OH末端。反应 不受底物分子链长短的限制。哺乳动物细胞也有 这种激酶。
T4噬菌体基因43编码


2种酶活性：
5 ´→3 ´ 聚合活性，3 ´→5 ´ 外切活性，外切活性 比E.coli DNA聚合酶I高200倍。 取代活性：体系中只含一种dNTP时， 该酶3 ´→5 ´ 外切活性从dsDNA的3 ´ 端降解核苷酸，直到该 dNTP出现。 通过聚合作用填补单链缺口，补平经限制酶切割 后形成的DNA 3′隐蔽末端；

基因操作中使用T4DNA连接酶，因为连接 效率高，既可以连接粘性末端，又可以连 接平末端。T4DNA连接酶也可在较高温度 下进行（22-30度）反应。
动物细胞和噬菌体
大肠杆菌及其它细菌
切口（nick)
缺口（gap)

基因克隆实验中，DNA分子的连接往往需 要合适的粘性末端以保证连接的方向性和 连接效率。通常这些粘性末端可用相同的 限制酶消化被克隆的DNA和载体分子获得， 通常不总能做到，有时载体分子含粘性末 端，而被克隆的DNA片段是平末端。此时 可采用下面3种方法之一可把粘性末端连接 到平端DNA上。

另一种磷酸转移方式是交换反应，ATP过量时， T4多核苷酸激酶将正常DNA5’ -磷酸转移给ADP， 同时DNA又从γ-32P-dATP获得放射性标记的γ-磷 酸。
正向反应比交换反应常用、有效。 Midgley(1985)将T4噬菌体多核苷酸激酶基因克隆 到大肠杆菌中，获得高效表达。

T4 多核苷酸激酶的催化活性
大肠杆菌有三种不同类型的DNA聚合酶: DNA聚合 酶I 、DNA聚合酶II、 DNA聚合酶III， 基因工程中 DNA聚合酶I 最有用，主要用来制作核酸杂交探针。探 针指能与某种被研究的核酸序列特异性结合并带有标记 的寡核苷酸分子，标记可以是放射性同位素或非放射性 物质，可标记在探针序列的5 ´端或3´端，也可以在其他 区域甚至探针的全长。 条件：4种dNTP、Mg 2+、3´-OH引物、DNA模板； 活性：单链或双链活性，5 ´→3 ´ 聚合酶，5 ´→3 ´ 外 切酶和3 ´→5 ´ 外切酶。
3.2 DNA连接酶与DNA 分子的体外连接 3.2.1 DNA连接酶

基因工程是基因重组，是不同DNA片断在试管 内的重新连接，连接反应需要DNA连接酶，能 催化2个DNA片断相邻的3-OH和5-P形成磷酸 二酯键，有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连 接酶。最适温度37度，但因为体外该温度下粘 性末端配对的碱基不稳定，一般将温度控制在 4-16度，并适当延长反应时间（2h或过夜），

T4 多核苷酸激酶的交换活性

用途：


标记DNA5’-末端制备杂交探针
对人工合成的缺失5’-P的寡核苷酸进行磷 酸化，如衔接物、接头等克隆元件的5’-磷 酸化，测序引物的5’磷酸标记等。
3.4.3 碱性磷酸酶



2种：细菌碱性磷酸酶（BAP）来源于大肠杆菌；小 牛肠碱性磷酸酶（CIP）来源于小牛肠道， CIP活性 比BAP 高10-20倍。 功能：脱掉5’-磷酸，使之变为5’-OH。 用途：1 化学法测序时，脱掉DNA的5’-磷酸，再进行 标记；2 为防止线性化载体分子自我连接降低重组率， 先脱掉DNA5’-磷酸，插入片段无此处理，可与载体 分子3’-OH形成共价键，封闭结果可防止重新解链， 如果在连接反应后导入宿主细胞前，对连接混合物作 适当加热，则未插入外源片段的载体分子解链成线性 分子，不能形成转化子克隆，只有携带插入片段的重 组体分子形成转化子克隆。
它杂质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS及高 浓度盐离子都有可能抑制酶的活性； （2）DNA甲基化程度。限制酶不能切割甲基化的DNA 序列位点，可利用来保护DNA序列； （3）不同限制酶有不同最适酶切温度，大多数是37度； （4）DNA不同构型影响酶活性，线性分子比超螺旋结构 容易切割； （5）缓冲液成分（需含氯化镁、氯化钠或氯化钾提供离 子强度、Tris-HCl维持稳定的pH（7.4最佳）、β-巯基乙醇 或二硫苏糖醇（DTT）保持酶稳定性、小牛血清（BSA） 有助于酶稳定等。




用途： 标记dsDNA的末端； 以取代反应标记dsDNA； 借助3 ´→5 ´ 外切活性，部分消化dsDNA 标记DNA片段作杂交探针。
5 T7 DNA聚合酶

从感染T7噬菌体的大肠杆菌培养物中纯化而来的 复合型核酸聚合酶，2种亚基，一种T7噬菌体基因5 编码的蛋白质有聚合酶和3 ´-5 ´外切活性，另一种 是大肠杆菌基因编码的铁硫还蛋白，增加大亚基对 模板的亲和力。 2种酶活性： 5 ´→3 ´ 聚合活性，3 ´→5 ´ 外切活性 具有极高的连续合成数千个核苷酸的能力，是已知 合成能力最强的DNA聚合酶。 3 ´→5 ´ 外切活性的外切活性也很强，是Klenow 酶 的1000倍。
5 ´ →3 ´ 聚合酶活性
5 ´ →3 ´ 外切酶活性

3 ´ →5 ´ 外切酶活性


主要用途：DNA切口平移制备杂交探针
链的取代和切口平移 切口平移法制备32P-标 的DNA分子杂交探针
切
2、Klenow 酶（大片段） 大肠杆菌Pol I 用枯草杆菌蛋白酶处理， 失去5 ´→3 ´外切酶活性 (Klenow 酶），分 子量67kD ，称Klenow 酶。具有5 ´→3 ´的 聚合活性，3 ´→5 ´ 外切酶活性。

主要从原核生物分离纯化出来，是原核生物自我保 护的机制（限制和修饰系统）。限制指细菌可通过 限制性内切酶的切割作用，破坏入侵的噬菌体DNA， 导致噬菌体的寄主范围受到限制。修饰作用指寄主
菌本身的DNA，在合成后就被自身的甲基化酶甲基
化，使自身DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶 的破坏。哺乳动物没有限制修饰系统。


3.5 DNA 外切酶
核酸外切酶（exonucleases）：从多核苷酸链的一头 按顺序催化降解核苷酸的酶。按作用特性的差异可 分为单链核酸外切酶（如exo I、 exo VII等 ）和双链 核酸外切酶（如exo III、λ exo等）。



3.6 S1单链核酸内切酶
单链特异的核酸内切酶
DNA聚合酶在生物体内以一条DNA链为模板合 另一条互补DNA链。基因工程中常用的常用的有大 肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow大片段、T7 DNA聚合 酶、 T4 DNA聚合酶、修饰过的T7 DNA聚合酶、耐 热的TaqDNA聚合酶及逆转录酶等。
3.3.1 DNA 聚合酶I与核酸杂交探针的制备 1、DNA聚合酶I（Pol I）




用途： 经化学处理使酶失去3 ´→5 ´ 外切活性，变 成新的修饰的T7聚合酶，在单链模板的聚 合速度增加了3倍，是双脱氧法进行长片 段DNA序列测定的理想用酶，商品名为测 序酶。 也可用于填补3 ´隐蔽末端和末端标记。
6 Taq DNA聚合酶




第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，65kD，Erlish在 一株水生噬热杆菌中提取获得。 5 ´→3 ´ 聚合活性， 5 ´→ 3 ´外切活性，耐高温， 70度2hr反应后活性保持90%以上。 不具3 ´→ 5 ´外切活性，错误掺入率相对较大。 Saiki（1988）将Taq酶用于PCR技术，对DNA特定 序列进行体外扩增，产物不是平末端， 3 ´ 有一个 突出的A。 已发现更多的耐热DNA聚合酶，保真度增强，如 Pfu，还有3 ´→ 5 ´外切活性，可将错配碱基切除， 出错率最低，产物为平末端。

在DNA分子克隆中主要用途：

通过聚合作用填补单链缺口，补平经限 制酶切割后形成的DNA 3′隐蔽末端，标 记DNA 3′末端； 合成cDNA第二链；


DNA序列测定等。
用klenow酶标记DNA片段末端的基本流程
3、依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶）

活性：以RNA或DNA为模板合成DNA，引物可以

3.1.3限制性内切酶的命名法 以EcoRI为例：E— 寄主菌的属名第一字母 （Escherichia)；co—寄主菌种名的头两个字母 （coli）；R— 寄主菌菌株或型；I— 具有几个 不同限制修饰系统时，用阿拉伯数字表示限
制修饰体系。
3.1.4影响限制性内切酶活性的因素 （1）酶的活性很大程度取决于DNA纯度，溶液内含其
基因克隆的酶学基础

重组DNA实验中常用的若干种工具酶
粗略地可分为限制酶、连接酶、聚合酶和 修饰酶，以限制性内切酶和DNA连接酶的 作用最突出。


3.1 限制性内切酶与DNA分子的体外切割


3.1.1 限制性内切酶的类型
能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列（4－
6bp），并在真核m生物基因工程及真核基因在原核 细胞的表达开拓通路；
mRNA反转录与PCR偶联分离真核基因； 合成核酸探针，对有5’突出末端的DNA片段 作末端标记（补平反应）。

4 T4 DNA聚合酶


按酶蛋白的组成和裂解DNA的方式分为I、II、IIII三类。


3.1.2 II 型限制性内切酶的基本特性
H.O Smith和K.W. Wilcox 1970年在流感噬血菌Rd菌株 中分离处HindII。 识别特异的未甲基化修饰DNA序列，长度4-8个核苷酸; 识别序列多呈180度旋转对称（回文结构）; 少数可识别2种以上核苷酸序列; 作用形成的DNA断裂切口有2种类型： 粘性末端和平末端 粘性末端：断裂位置交错，对称围绕在中心轴， 5´端 突出或3 ´端突出； 平末端：断裂位置在中轴上。
识别序列与DNA来源无关，对不同物种DNA普遍适用；
识别序列长短涉及对DNA分子的切割效率，短的出现频 率高；
识别序列有相邻序列效应，限制酶切割DNA时，识别序 列侧翼需有一个和几个核苷酸； 识别序列有位点偏爱现象，侧翼序列的核苷酸组成与酶 的切割效率有关；
星号活性。在非最适反应条件下（高的酶浓度甘油浓度、 低离子强度、高pH、Mn取代Mg），有些限制酶识别 序列特异性发生改变，导致在非识别序列位点处切割 DNA分子。


同裂酶：指识别序列相同的不同限制 性内切酶，可有相同的（Bam HI和Bst I G↓GATCC)和不同的切割位点(Sma I和 Xma I) 的限制酶互称为同裂酶。
同尾酶：识别序列不同，但能切出相 同的粘性末端的不同的限制酶互称为 同尾酶。


限制性内切酶的识别序列与DNA切割