柠檬酸应用及发展

第一章综述

1.1 柠檬酸简介[1]

柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。

柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid）、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸（2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid）。

分子式：C

6H

8

O

7

（相对分子质量：192.13）

物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。

化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。

1.2柠檬酸的基本性质及用途[4]

柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理性能、化学性能、衍生物的性能，是广泛应用于食品、医药、日化等行业[2]最重要的有机酸。

（1）用于食品工业：柠檬酸在食品工业占生产量的75%以上，因为柠檬酸有温和爽快的酸味，所以普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。在所有有机酸的市场中，柠檬酸主要用作清凉饮料、果酱、水果和罐头等的酸性调味剂，也可用作食用油的抗氧化剂、pH调节剂等。

（2）用于化工和纺织业：柠檬酸在化学技术上可作化学分析用试剂，用作实验试剂、色谱分析试剂及生化试剂；用作络合剂，掩蔽剂；用以配制缓冲溶液，如柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液还可用于烟气脱硫[6]。采用柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能[5]，可以迅速沉淀金属离子，防止污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性；使污垢和灰分散和悬浮；提高表面活性剂的性能，是一种优良的鳌合剂；可用作测试建筑陶瓷瓷砖的耐酸性的试剂。

（3）用于禽畜生产[7]：在仔猪饲料中添加柠檬酸，可以提早断奶，提高饲料利用率5%～10%，增加母猪产仔量。在生长育肥猪日粮中添加1%～2%柠檬酸，可提高日增重，降低料肉比，提高蛋白质消化率，改善肉质和胴体特性。柠檬酸稀土是一种新型高效饲料添加剂，适用于猪、鸡、鱼、虾、牛、羊、兔、蚕等各种动物，具有促进动物生长，改善产品品质，提高抗病能力及成活率，提高饲料转化率，缩短饲喂周期等特点。

1.3柠檬酸的生产方法

柠檬酸的生产方法主要是从天然植物中提取和生物发酵法两种, 目前以发酵法生产柠檬酸为主[3]。

生物发酵法又分为表面发酵法、固体表面发酵法和液体深层发酵法[8]。固态发酵能耗小但劳动力大, 占地面积大, 不适合大规模的生产应用。深层通风发酵法采用不锈钢罐体, 机械搅拌通风, 微生物在液体中分布均匀, 发酵时不生成孢子, 全部菌体细胞用于代谢柠檬酸, 发酵速度高, 实现了机械化或自动化操作, 利于大规模生产.

1.4 黑曲霉积累柠檬酸的机理

1.41柠檬酸合成途径[9]

1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌糖化后产生高浓度的葡萄糖。

2）、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP（糖酵解途径或者）、HMP（磷酸戊糖循环）两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。

1.42黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控

（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节

1.铵离子能够解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用，对该酶表现出激活作用；铵离子的浓度与柠檬酸生成速度、积累有密切关系，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量；

2.培养基中锰缺乏时，黑曲霉的合成代谢受损伤，菌体结构不完整，但铵和氨基酸水平升高（锰缺乏时，蛋白质、核酸合成受阻，导致铵离子升高）

（二）TCA环的调节

1.柠檬酸合成酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点.柠檬酸发酵菌的柠檬酸合成酶对乙酰COA的亲和力随草酰乙酸浓度的提高而增大；

2.顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活→TCA环阻断→积累柠檬酸,顺乌头酸水合酶需要Fe2+ ，故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+，顺乌头酸水合酶活性降低；顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活；

黑曲霉乌头酸水合酶催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸 = 90：7：3的平衡关系；

黑曲霉对NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种依赖于辅酶NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与TCA循环有关，它们受到生理浓度柠檬酸的抑制

3. α-酮戊二酸脱氢酶：黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断）。

1.43黑曲霉积累柠檬酸的机理[9]

（1）由于严格限制供给锰离子等金属离子,或筛选耐高浓度锰离子、锌离子、铁离于等金属离子的菌株,降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力,使细胞中形成高水平的铵离子,从而解除柠檬酸和ATP 对PFK酶的反馈抑制,使EMP 的代谢流增大。

(2) 黑曲霉中存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链,对氧敏感,但不产生ATP ,这样使细胞内的ATP 浓度下降。因而减轻了ATP 对PFK、CS 的反馈抑制,促进了EMP 的畅通,增加柠檬酸的生物合成。

(3) 丙酮酸羧化酶是组成性酶,不受代谢调节控制,可源源不断地提供草酰乙酸,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA 和CO2固定反应取得平衡,保证前体物乙酰CoA 和草酰乙酸的提供,柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱,增强了柠檬酸的合成能力。

(4)α- 酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏,使黑曲霉中的TCA 变成