洋葱苯丙氨酸解氨酶基因AcPAL2的克隆与表达分析

园艺学报，2015，42 (3)：505–512.

Acta Horticulturae Sinica

doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0900；http：//www. ahs. ac. cn 505

洋葱苯丙氨酸解氨酶基因AcPAL2的克隆与表达分析

梁毅1，刘小义2，张洪伟1,*，谭武平1

（1北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京京研益农科技发展中心，北京100097；2中国质量认证中心，北京100070）

摘 要：利用简并PCR技术和RACE技术克隆得到了一条洋葱的苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因全长cDNA序列。该cDNA序列全长2 349 bp，编码长685个氨基酸残基的多肽序列，命名为AcP AL2。Blast

分析表明该序列与虎眼万年青Galtonia saundersiae、野蕉Musa balbisiana的相似性均较高。Real-time PCR

表达及花青素含量分析表明，红皮洋葱该基因表达量最大，而黄皮和白皮洋葱表达量极低；在红皮洋葱中

该基因在膨大初期大量表达，并迅速降低至一定程度后趋于相对平稳表达，且与花青素的积累过程相一致。

关键词：洋葱；花青素；AcP AL2；基因表达

中图分类号：S 633.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0505-08 Molecular Cloning and Expression Analysis of AcPAL2 in Onion

LIANG Yi1，LIU Xiao-yi2，ZHANG Hong-wei1,*，and TAN Wu-ping1

（1Beijing Vegetable Research Center of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops in North China，Beijing Jing Yan Yi Nong Sci-Tech Development Center，Beijing 100097，China；2China Quality Certification Center，Beijing 100070，China）

Abstract：A full-length cDNA of phenylalanine ammonia lyase-homologue（AcP AL2）was isolated from onion using degenerate PCR and the RACE（rapid amplification of cDNA ends）method. The full-length cDNA is 2 349 bp long，which encodes a polypeptide of 685 amino acids. Blast analysis indicate that the polypeptide shares a relatively high similarity with Galtonia saundersiae and Musa balbisiana. Real-time PCR analysis demonstrate that AcP AL2 mRNA express abundantly in red onions，but extremely low in yellow and white onions；AcP AL2 in different bulb swelling stage in red onion has a high expression during the initiation，then express stable after a rapid decrease. And anthocyanin content change also shows the same tendency with AcP AL2 expression.

Key words：onion；anthocyanin；AcP AL2；gene expression

植物颜色主要是由类黄酮素（Flavonoids）、类胡萝卜素（Carotenoids）和甜菜碱素（Betalains）的不同分布所决定，其中类黄酮化合物花青素主要决定植物的红色、紫色和蓝色（Field et al.，2001）。

收稿日期：2014–11–28；修回日期：2015–01–26

基金项目：国家公益性行业科技项目（20093018）；‘十二五’国家科技支撑计划项目（2012BAD02B00，2011BAD35B07，2012BAD50G01）；北京市科委育种平台三期项目（D111100001311002）；北京市常规育种财政专项（2014-509）

* 通信作者Author for correspondence（E-mail：zhwwawzjcx@）

Liang Yi，Liu Xiao-yi，Zhang Hong-we，Tan Wu-ping .

Molecular cloning and expression analysis of AcPAL2 in onion.

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花青素的生物合成以苯丙氨酸为直接前体，经历一系列的酶促反应及不同的羟基化、糖基化、甲基

化、酰基化修饰后在液泡中汇集（Holton & Cornish，1995），其中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine

ammonia-lyase，PAL）催化L–苯丙氨酸生成反式肉桂酸，是花青素生物合成反应中的第一个酶，

也是多种次生代谢产物的关键酶和限速酶。

早在1960年，Neish就证实了PAL可以催化花青素的合成（Neish，1960）。用白光、蓝光或红

光照射尾穗苋的黄化苗，可以使PAL活性不同程度上升，并且发现其特有色素苋红素大量积累（应

初衍和薛应龙，1984）；Nakazawa等（2001）研究发现在牵牛花花蕾中，PAL基因转录水平的增加，

会使PAL活性升高，进而使花青素含量也大量增加，说明牵牛花花蕾PAL活性和转录水平均与花

青素积累有关；史宝胜等（2007）认为可以通过增加光照强度来增加紫叶李叶片PAL酶的活性，促

进花青素大量合成而使其叶片迅速呈现红色。另外，还有人通过调节PAL基因的表达模式，有效地

改变了矮牵牛、烟草和菊花等植物的花色。洋葱（Allium cepa L.）根据鳞茎颜色的不同，分为红皮、

黄皮和白皮等不同种类。本研究中以红皮洋葱为试验材料，利用RT-PCR与RACE技术分离并克隆了

1条PAL基因全长cDNA序列，并对其进行部分序列分析，及其表达情况和花青素含量关系的分析，

为明确PAL基因与花青素合成之间的关系提供依据，为进一步探究洋葱花青素的合成途径奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

在北京市农林科学院蔬菜研究中心农场种植白皮洋葱品种‘白雪’、红皮洋葱品种‘中生赤玉’

和黄皮洋葱品种‘黄金大玉葱’，常规栽培管理。

于鳞茎开始膨大（2013年4月下旬）后的不同时期采集红皮洋葱鳞茎，于鳞茎开始膨大30 d

时采集红、黄、白皮洋葱鳞茎，采集后立即液氮速冻，保存于–80 ℃，用以提取总RNA。

1.2基因全长cDNA序列克隆

从NCBI下载洋葱近缘植物（玉米，大蒜，石蒜，小果野蕉，毛竹）的PAL基因序列，根据这

些序列，利用软件Primer Premier 5.0设计简并引物（表1）。

表1 涉及到的引物及其序列

Table 1 Primers involved in the study and its sequences

用途Purpuse 引物名称Primer name 核苷酸序列*（5′→3′）Nucleotide sequence*

中间片段扩增Intermediate fragment amplification PAL-de-F GGHATYCGVTTYGARATCCT

GTTGTCCATGGANACVCCRAT PAL-de-R

全长cDNA 扩增Full-length cDNA amplification P1FL GAAAAGGAAAGGCCAATTTGTTCATAT

5′-RACE PCR扩增5′-RACE amplification P1R-1 AATCTGACCTGGATGATGTTTC

ACTGCAAGAACATTGGCCTCA P1R-2

Actin内参引物Actin Primers AcActin-S ACACGGCCTGGATAGCAACAT

AGAGCAGTATTCCCAAGCATT AcActin-A

Real-time PCR引物Specific primer for real-time PCR P1-S GGGCAACTTCGCATAGGAGG

GCTGTTCAAGAAAGCGGCAA

P1-A

* H = A/T/C；V = G/A/C；R = A/G；Y = C/T；N = A/T/C/G。

以开始膨大30 d后的红皮洋葱鳞茎作为试验材料，使用试剂TotalRNAExtractor（Trizol）（上海

生工）提取总RNA，PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）合成cDNA第一链，以

简并引物PAL-de-F和PAL-de-R扩增PAL基因。