高效液相色谱条件优化实验

高效液相色谱条件优化实验

一、实验目的

1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理。

2．学习高效液相色谱仪的使用。

3．体会流动相种类及配比对分离结果的影响。

4．掌握高效液相色谱柱性能评价指标的测定及计算方法。

二、基本原理

高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法。本实验的主要目标是通过对流动相条件进行优化，使被测混合样品中各组分之间的分离度大于1.5，峰形基本对称。

高效液相色谱柱的柱效通常用有效塔板数来衡量，其计算公式如下：

22

1/25.5416R R t t n Y Y ⎛⎫⎛⎫== ⎪ ⎪⎝⎭⎝⎭

式中：t R 为组分的保留时间，Y 1/2为色谱峰的半峰宽度，Y 为色谱峰的峰底宽度。

选择性因子是评价色谱柱对两组分分离选择性的指标。与气相色谱不同的是：在高效液相色谱中，由于死时间的精确测定较为困难，因此本实验中采用保留时间之比作为评价分离选择性的指标。 (2)

(1)R R t t α=

分离度是评价色谱柱分离总效能的指标，两个色谱峰的半峰宽分离度可以通过下式计算：

()(2)(1)

1/2(1)1/2(2)-12R R t t R Y Y '=+，R =0.59R '

三. 已具备的色谱仪器条件

1．Agilent HP1200高效液相色谱仪，可变波长紫外检测器

2．色谱柱：C18键合固定相（15cm ⨯4.6mm ，5um ）

3．保护柱：C18键合固定相（0.75cm ⨯4.6mm ，5um ）

四、样品信息

1．苯酚、邻苯二甲酸氢钾、对甲苯磺酸钠混合水溶液

2．苯酚、邻苯二甲酸氢钾、对甲苯磺酸钠标准溶液

五、实验内容

1．混合样品的流动相条件优化

2．各色谱峰的定性鉴定

六、数据记录及处理

1．记录实验条件优化过程，包括实验条件、分离情况定性描述。

2．记录最优条件下各色谱峰的保留时间t R和半峰宽Y1/2。

3．色谱柱理论塔板数、选择性因子、分离度的测定与计算。

4．根据实验结果分析讨论色谱条件对分离的影响。

七、思考题

1．在反相键合相色谱中，常用的流动相的洗脱强度？

2．对于弱酸样品，如何获得较好的峰形和保留？

3．对于强酸样品，如何获得较好的峰形和保留？

八、实验前的预习要求

实验开始前需要提交实验方案：包括

1．初始色谱条件（写出设计依据）

2．定性方法（写出理由）

3．定量方法（如果需要做定量，你会选择何种方法，为什么？）