菌种选育3354页PPT

耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵 能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提 高醪液酒精浓度。
而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘 油的性能，可用于甘油发酵。
耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分 别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗 环境下一次性筛选获得。
2）阶梯性筛选法
药物抗性即抗药性突变株可在培养基中 加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作 用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞 中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出 菌落。但是在相当多的情况下，无法知道 微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这 时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯 性筛选法。
耐高温菌株法筛选：将处理过的菌悬 液在一定高温下处理一段时间后再分离。 对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的 细胞则对高温有较好的耐受性。
耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在 于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏 季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所 产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊 的工艺过程。
梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选， 以提高相应代谢产物的产量。
异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类 似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有 可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成 更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验 证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。 这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆 醇的高产菌株。
菌种筛选方案
在实际工作中，为了提高筛选效率， 往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的是删去明确不符合要求的大部 分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留 下来，以多为，主使优良菌种不致于漏网。 复筛的目的是确认符合生产要求的菌株， 以质和精为主，应精确测定每个菌株的生 产指标。
筛选方案： 第三轮、第四轮…(操作同上)
抗性突变株的筛选常用的有一次性筛 选法和阶梯性筛选法两种手段。
1）一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致 死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。
抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体 敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接 入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不 能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时 出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体 突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长 繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。
微生物的突变类型多，可分为两大类， 第一类为形态突变株，包括菌落形态，菌丝 形态，分生孢子形态。另一类是生化突变株， 包括抗性突变型，营养缺陷型，条件致死突 变型，产量突变等。
因此，要在大量的细胞中寻找真正需要 的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简 洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的 关键。
在提高筛选品质方面，由于过去对菌 体生理了解不够，只能随机筛选（random selection），大量筛选无特定标记的突变株， 因此筛选效率不佳；其后由菌株的生理研 究，以及由实际研发的经验，发展出合理 定向筛选（ rational selection ）技术。
初筛和复筛工作可以连续进行多轮， 直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选 方案，不仅能以较少的工作量获得良好的 效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很 高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。
筛选获得的优良菌株还将进一步做工 业生产试验，考察它们对工艺条件和原料 等的适应性及遗传稳定性。
8 抗性筛选
抗性突变株的筛选相对比较容易， 只要有10–6频率的突变体存在，就容易 筛选出来。
图若干代谢产物的生产菌
代谢产物 肌苷 肌苷 腺嘌呤 烟碱酸 色氨酸 甲硫氨酸 酪氨酸 亮氨酸 吡咯叠氮
生产菌 短小芽孢杆菌 棒杆菌 鼠伤寒沙门氏杆菌 衣藻 伤寒沙门氏杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 伤寒沙门氏杆菌 金色假单胞菌
代谢拮抗物 8-氮鸟嘌呤 6-巯鸟嘌呤 2,6-二氨基嘌呤 3-乙酰吡啶 6-甲基色氨酸 乙硫氨酸 对氟苯丙氨酸 三氯-DL-亮氨酸 6-氟色氨酸
(1)梯度平板法(Gradient plate) 先将10ml左右的一般 固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结 成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml含适当浓度的 药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上 层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到 浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上， 药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓 度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌 抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗 性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会 形成的明显界线。
9 推理选育 (Rational Selection)
抗生素产生菌的推理选育是建立在抗 生素生物合成机制已知或较清楚的基础上 按需要定向选育的一种方法。近几年研究 较多，应用较广，成效显著。就一些抗生 素而言，经过多年的研究，其代谢机理已 较清楚。实践证明，推理选育在抗生素育 种上的应用其效果远比传统的随机筛选优 越得多，只需适量筛选，即可达到所期望 的目的。
阶梯性筛选法也有一定的缺点， 它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌， 而低浓度区域面积较大，优良的抗性 突变株若被分散在低浓度区域或远离 纸片的区域，则可能没有被检出，因 此，漏检的几率较大。
(2) 纸片扩散法
纸片扩散法与梯度平板法的原理类似， 用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸 片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥， 放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的 培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察 围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就 是抗性菌。
因为药物抗性常受多位点基因的控制， 所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间 上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物， 而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处 理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。
阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养 皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选 到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐 药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗 漏。阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的 筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接 受的药物浓度情况下。