博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
生命科学中的基因修饰技术
生命科学中的基因修饰技术随着基因科学的不断发展，基因修饰技术已经逐渐成为生命科学中的一个关键领域。
基因修饰技术可以通过改变或修复人类或动物体内的基因来治疗疾病，甚至改善生物体的功能。
此外，基因修饰技术还可以用于改善农作物或动物品种，提高食物品质，增加农业产量等。
基因修饰技术的种类基因修饰技术有很多种类，包括基因敲除、基因导入、CRISPR/Cas9基因编辑技术等。
其中最常见的技术为基因敲除和基因导入技术。
基因敲除是指人工地使某个基因失去活性或抑制其表达的过程。
通过基因敲除技术，研究人员可以了解一个基因在细胞或生物体中所起的作用。
此外，基因敲除也有助于发现某些基因与疾病之间的关联，从而开展更精准的疾病治疗。
相对于基因敲除技术，基因导入技术则是指将人工合成的基因导入到细胞或生物体中的过程。
通常情况下，研究人员利用基因导入技术将一个正常的、健康的基因导入到缺陷细胞或身体中，以恢复生物体的健康状态。
例如，利用基因导入技术可以导入正常的血红蛋白基因来治疗镰状细胞贫血。
CRISPR/Cas9基因编辑技术是在基因敲除和基因导入技术的基础上发展出来的一种新型的基因修饰技术。
它具有更高的精准度和更快的速度。
此外，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究人员可以更精确地修改某个基因的序列，以修饰人类或动物的性状。
基因修饰技术在生物医学中的应用基因诊断、基因治疗和基因药物研究是基因修饰技术在生物医学中的重要应用。
基因诊断是指通过检测人体内的基因变异来诊断某种疾病。
例如，利用基因诊断技术可以检测出乳腺癌或卵巢癌的遗传风险，从而及早进行预防和治疗。
基因治疗则是指利用基因修饰技术来治疗某些遗传性疾病。
例如，利用基因导入技术可以将正常的基因导入到患有缺陷基因的细胞或组织中，从而治疗疾病。
此外，CRISPR/Cas9基因编辑技术则具有更为精准的基因治疗应用前景。
基因药物研究则是指利用基因修饰技术来研究新型药物。
基因药物对某些疾病有着极佳的疗效，因此成为了当今生物医学领域中备受关注的领域。
植物功能基因组研究中的基因敲除技术
植物功能基因组研究中的基因敲除技术植物基因敲除技术是近年来植物功能基因组研究中的一项重要技术。
通过该技术可以精准地删去植物基因组中的某个基因，从而研究该基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的原理和应用。
一、植物基因敲除技术的原理植物基因敲除技术是通过基因编辑技术实现的。
目前主要有CRISPR/Cas9和TALEN两种技术用于植物基因编辑。
这两种技术都是利用人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA 序列，从而实现基因敲除。
先来介绍一下CRISPR/Cas9技术。
CRISPR是一种天然存在于细菌中的免疫系统。
通过CRISPR系统，细菌可以识别并摧毁侵入其体内的病毒DNA。
科学家们发现，CRISPR系统中有一种酶叫做Cas9，可以切割DNA序列。
利用人工合成的RNA序列，可以将Cas9定位到需要切割的基因上，并切割掉该基因。
这样就实现了精准的基因敲除。
TALEN技术原理类似于CRISPR/Cas9，也是通过人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA序列。
TALEN技术主要是利用一种叫做TALEN（转录激活样核酸酶）的酶来实现基因敲除。
二、植物基因敲除技术的应用植物基因敲除技术已经成为植物功能基因组研究中的一项重要技术。
它可以用于研究植物生长、发育和代谢等方面的功能。
以下是该技术的一些具体应用：1.研究基因功能植物基因敲除技术可以用于研究基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
通过敲除某个基因，可以观察其对植物生长、发育和代谢等方面的影响。
这种方法可以帮助科学家们更好地了解植物基因的功能。
2.筛选基因植物基因敲除技术可以用于筛选植物基因。
在研究植物新陈代谢方面，需要筛选大量的植物基因，以了解这些基因在植物代谢中的作用。
植物基因敲除技术可以快速地筛选出与目标代谢过程相关的基因，从而加速研究进程。
3.改良植物品种植物基因敲除技术可以用于改良植物品种。
基因敲除技术的原理及应用
基因敲除技术的原理及应用1. 什么是基因敲除技术？基因敲除技术是一种用于研究基因功能的重要工具。
它通过针对特定基因进行序列特异性的基因组改变，从而使该基因在细胞或有机体中无法正常表达。
基因敲除技术可以通过多种方法实现，包括CRISPR/Cas9技术、RNA干扰技术等。
2. 基因敲除技术的原理基因敲除技术的原理是通过引入带有特定敲除序列的DNA或RNA分子，干扰目标基因的正常表达，从而导致该基因在细胞或有机体中无法产生功能性蛋白质或RNA。
具体的原理可以通过以下步骤进行解释：•设计敲除序列：根据目标基因的DNA序列，设计敲除序列，一般是由数十个碱基组成的寡核苷酸序列。
这个敲除序列将与目标基因的DNA序列互补匹配。
•传递敲除序列：将设计好的敲除序列导入目标细胞或有机体中。
传递方式可以包括转染、电穿孔等多种方法。
•敲除序列与目标基因结合：敲除序列与目标基因的DNA序列互补配对，形成双链结构。
这种配对会触发细胞内的DNA修复系统。
•DNA修复系统介入：细胞内的DNA修复系统会介入敲除序列与目标基因的配对，将目标基因的DNA序列修复或剪切。
•基因无法表达：通过以上步骤，目标基因的DNA序列被修复或剪切，导致基因在细胞或有机体中无法正常表达。
3. 基因敲除技术的应用基因敲除技术在生物学研究和生物医学领域有着广泛的应用。
下面列举几个常见的应用领域：•基因功能研究：通过敲除目标基因，研究其对细胞生理过程和有机体发育的影响，揭示基因功能与疾病发生之间的关系。
•疾病模型构建：利用基因敲除技术，构建动物模型来模拟人类遗传疾病，研究病理机制、筛选新药物。
•基因治疗：通过基因敲除技术，研究特定疾病相关基因的功能，为基因治疗提供理论和实验依据。
•农业转基因研究：基因敲除技术在农业领域可以用于研究植物基因的功能，提高作物抗病虫害能力、调控植物生长和发育等。
4. 基因敲除技术的优势与局限性基因敲除技术具有以下优势：•高效性：基因敲除技术可以精确地靶向特定基因，对其进行敲除，从而实现高效的基因敲除。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术基因敲除是一种通过将目标基因删除或改变其序列来研究该基因功能
的方法。
这一技术通常使用胚胎干细胞或转基因动物模型，方法是设计一
种包含两个草图和背靶RNA的末梢引物，然后将引物引导向目标基因的编
码序列，并在细胞合成双链DNA后通过NHEJ或HDR途径来进行切除修复，这会导致目标基因的敲除或替代。
通过比较敲除基因和野生型对照组织的
差异，科学家可以确定该基因在特定生物过程中的功能。
基因编辑细胞实验，看这篇就够了！
基因编辑细胞实验，看这篇就够了！相信在科研上默默努力的小伙伴一定听过或被安利过CRISPR-Cas9基因编辑技术，小编在初次了解到这个技术时，感觉它太强大了！特别是在基因功能研究中，常常会用到CRISPR-Cas9技术，例如构建基因敲除、基因定点突变和基因敲入的细胞等，方便和高效的标签已经牢牢贴在它的身上。
今天带大家一起回顾CRISPR-Cas9在细胞实验上的帮助吧！1.基因敲除基因敲除（Knock out，KO）是基因功能研究中的“减法”套路，也就是基因功能缺失的研究思路，当目的基因被敲除，基因功能丧失后，所出现的细胞表型变化我们便认为与该基因相关。
同时，这个“减法”套路可以用RNAi技术在转录水平上实现，但RNAi技术的调控原理是靶向mRNA，与CRISPR-Cas9技术的KO在效果上存在差异。
那么，下面给大家回顾一下整个敲除实验的流程和注意细节！首先，使用CRISPR-Cas9进行敲除基因有两种策略——移码敲除和片段敲除。
两种策略各有优缺点，需根据敲除细胞的类型和目的基因信息来综合选择。
设计合理有效的sgRNA是我们最终成功实现基因编辑的重要前提。
这里需要注意的是要尽可能选择切割效率高效和特异性好的sgRNA，避免影响其他基因和脱靶等情况。
获取sgRNA后，我们需要将其和Cas9转导到细胞内，常用的方法有RNP法、质粒法和慢病毒法。
三种方法都各具特点，RNP法简便、快捷和敲除效率较好；慢病毒法的敲除效率高，但存在影响其它基因和脱靶的风险；质粒法方便、简易，但效率较低。
编辑过后的混合细胞池存在各种细胞类型，可通过稀释等方法获得单克隆细胞，然后再通过PCR和测序鉴定基因型，筛选目标基因型的单克隆。
如果使用片段敲除的策略（敲除200bp以上），可通过PCR扩增敲除片段附近的区域，通过比较与野生型的电泳结果，能直观地知道敲除结果。
当然也需要对扩增的PCR产物进行测序，进一步明确基因型。
如果是移码突变策略，则需要扩增靶区域进行测序，明确基因型。
基因编辑和基因修饰技术
针对多个基因或环境因素导致的复杂遗传病，基因编辑技术可用于调控相关基 因表达，减轻症状或延缓疾病进展，如糖尿病、高血压等。
农作物遗传改良
提高产量和品质
通过基因编辑技术改良农作物基因， 提高其产量、品质和抗逆性，如增加 抗旱、抗虫、抗病等性状。
创制新种质
利用基因编辑技术创制具有优异性状 的新种质，为农作物育种提供新的遗 传资源。
优点
高灵活性、可定制性。
应用领域
基因功能研究、遗传疾病模型构 建等。
Zinc Finger技术
01
技术原理
Zinc Finger是一种基于锌指蛋白的基因编辑技术，通过设计特定的锌
指蛋白识别并结合目标DNA序列，进而实现基因敲除、插入或修复。
02
优点
高特异性、可设计性。
03
应用领域
基因治疗、基因功能研究等。
功能性生物制造
人类进化探索
借助基因编辑技术，可以构建具有特定功 能的生物体或生物部件，用于生产高附加 值产品或解决环境问题。
基因编辑技术为人类进化研究提供了有力 工具，有助于深入了解人类基因组的结构 和功能，揭示人类进化的奥秘。
06 伦理、法律和社会问题
伦理问题
尊重生命和人的尊严
基因编辑技术可能改变人类生命的本质和尊严，引发对生 命价值和意义的深刻思考。
基因修饰
通过改变基因的表达或结构来改 变生物体的性状或特性的技术。 这包括基因敲除、基因沉默和基 因过表达等方法。
技术的发展历程
早期基因工程技术：20世纪70年代，科学家开始使用 重组DNA技术来研究和操作基因，这标志着基因工程
的诞生。
输标02入题
锌指核酸酶（ZFN）技术：20世纪90年代，ZFN技术 被开发出来，它允许科学家在特定位置切割DNA，从 而实现基因编辑。
分子生物学研究中的基因操纵技术
分子生物学研究中的基因操纵技术一、引言分子生物学一直是生物学研究的重要方向之一，其中基因操纵技术发挥着重要作用。
基因操纵技术是指通过人为手段改变生物体内某个基因的表达或结构，从而达到特定的研究目的。
本文将从基因操纵技术的定义、分类、原理、应用等方面进行探讨。
二、基因操纵技术的分类基因操纵技术可以根据其作用机理不同进行分类。
这里我们将其分为以下三种。
1. 基于功能的基因操纵技术：该技术是通过改变或剥夺一个基因的功能，来分析该基因的功能以及整个生物体的代谢和生理过程。
其中最常用的方法是Knockout（KO）和Knockin（KI）。
· Knockout技术：针对一个基因，将其打靶，使其失去功能。
常见方法包括基因敲除、RNA干扰、甲基化等方法。
例如，通过基因敲除技术，可以研究某个基因对细胞增殖、细胞分化或细胞凋亡的影响。
· Knockin技术：将外源DNA序列或它的突变体整合到目标基因的遗传位点上。
主要包括修饰基因的结构或功能，添加报告基因等。
例如，通过添加报告基因（如绿色荧光蛋白，GFP）在细胞和组织水平观察基因的表达和定位。
2. 依赖于DNA重组的技术：该技术是通过改变DNA序列，来寻找特定的功能基因组拆分，如插入外源DNA序列、通过替换来改变基因活性等。
其中最常见的技术为：·制造转基因：外源基因插入到宿主细胞中，形成转基因。
例如转基因水稻、转基因小麦等。
·化学诱变：通过化学诱变，诱发DNA之间的相互重组，引起植物基因的变异，从而筛选出有利的突变体。
例如，通过化学诱变对菜心、大葱、卷心菜和草莓等进行诱变。
·基因工程：通过基因工程技术，改变植物中代谢通路或抗病性基因等的表达或结构，从而提高植物的产量和耐受性。
3. 基于RNA技术的基因操纵技术：RNA技术主要通过基于RNA的基因靶向打靶靶向调节RNA特异性被调控的机制实现的。
包括RNA干扰（RNAi）和RNA修饰（RNAmod）。
动物基因编辑技术的研究与应用
动物基因编辑技术的研究与应用随着生物技术的不断发展，动物基因编辑技术也逐渐成为生物科学研究中的重要领域。
动物基因编辑技术是指通过人工手段对动物基因进行删减、插入或修改，从而达到精确控制动物基因表达，改变动物特性的目的。
该技术具有很高的准确性和灵活性，可以用于诊断和治疗遗传病、基因工程、生物学研究等方面。
一、动物基因编辑技术动物基因编辑技术主要包括三种方式：转基因、基因敲除和基因修饰。
1. 转基因技术转基因技术是指将外源基因或异种基因导入动物体内，从而使其产生新型或改良的性状。
该技术主要应用于生产优良动物品种，改进生物制品及其它方面。
转基因技术一般采用基因枪或基因导入技术将外源基因导入动物体内。
转基因技术的优点在于它可以在较短的时间内获得高水平的转基因动物，并且可以实现病毒抗性等目标。
2. 基因敲除技术基因敲除技术是指将目标基因取代或删除，从而达到产生相应突变体的目的。
该技术主要应用于研究基因功能、疾病的发生机理等方面。
基因敲除技术主要通过引入外源DNA（例如: Cre-loxP）或RNA干扰技术，从而消耗目标基因的产物。
3. 基因修饰技术基因修饰技术是指通过人为干预改变基因表达的过程，从而实现控制动物特性的目的。
常见的基因修饰技术包括：CRISPR/Cas9基因编辑技术、TALEN基因编辑技术和ZFN基因编辑技术。
基因修饰技术的特点在于它可以针对目标基因进行特异删减和修饰，并且可以通过筛选出致病基因，在体细胞及早期胚胎阶段对遗传病进行有效治疗。
二、动物基因编辑技术的应用动物基因编辑技术的应用范围非常广泛，从医学、食品安全、环境保护到基础学科研究等方面都有应用和发展。
1. 医学应用动物基因编辑技术在医学领域的应用主要是用于诊断和治疗遗传病和某些基因突变相关病症的研究。
这种技术可以精确地进行基因修饰和基因敲除，帮助治疗一些难以治疗的疾病，例如：肺癌、糖尿病、血友病等。
2. 食品安全应用动物基因编辑技术在食品安全方面的应用具有很大的前景。
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿101页PPT
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿101页PPT
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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博士专题：基因功能研究技术之基因敲 除及基因编辑技术讲课讲稿
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除与基因编辑技术
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
基因功能冗余验证
基因功能冗余验证（Genetic Redundancy Verification）是一种实验方法，用于确定在生物体中具有相似功能的多个基因之间是否存在功能冗余。
功能冗余是指在同一生物体内，两个或多个基因具有相似的功能，当其中一个基因失去功能时，其他基因可以替代其功能，从而维持生物体的正常生理功能。
在进行基因功能冗余验证时，研究人员通常会采用以下几种方法：
1. 基因敲除或敲低：通过基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）或RNA干扰技术（如RNAi），特异性地敲除或敲低目标基因，观察生物体的表型变化。
如果敲除或敲低某一基因后，生物体表现出明显的表型变化，说明该基因在生物体中具有重要功能。
2. 基因过表达：通过基因工程技术，将目标基因导入到生物体中，使其过量表达。
如果过表达某一基因后，生物体表现出与正常生物体相似的表型，说明该基因在生物体中具有重要功能。
3. 双基因敲除或敲低：同时敲除或敲低两个具有相似功能的基因，观察生物体的表型变化。
如果双基因敲除或敲低后，生物体的表型变化比单一基因敲除或敲低更严重，说明这两个基因之间存在功能冗余。
4. 遗传互补实验：将两个具有相似功能的基因分别导入到两个不同的突变体中，观察这两个突变体是否能够恢复正常表型。
如果两个突变体都能够恢复正常表型，说明这两个基因之间存在功能冗余。
通过以上方法，研究人员可以验证在生物体中具有相似功能的多个基因之间是否存在功能冗余，从而揭示这些基因在生物体中的重要作用和调控机制。
RNA干涉与基因敲除技术
RNA干涉与基因敲除技术基因编辑技术在生命科学领域有着广泛的应用，其中RNA干涉（RNA interference，RNAi）和基因敲除是两种常用的方法。
它们都可以用来研究和调控基因表达，但在实施过程中存在一些区别。
本文将重点介绍RNA干涉和基因敲除技术的原理、应用以及优缺点。
一、RNA干涉技术RNA干涉是一种常见的基因调控方法，通过沉默目标基因的mRNA从而抑制其表达。
其机制是通过转录和降解过程中的特定RNA 分子介导，主要分为siRNA（小干扰RNA）和miRNA（微小干扰RNA）。
下面将重点介绍这两种RNA干涉技术的原理和应用。
1. siRNA技术siRNA是由外源DNA合成的双链RNA分子，在细胞内由Dicer酶催化切割形成20-25个碱基的小分子干扰RNA（small interfering RNA）。
这些干扰RNA与RNA诱导靶向基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，并导致靶向mRNA的降解或翻译抑制。
siRNA技术一般通过载体转染或合成siRNA直接转染的方式传递到细胞。
siRNA技术在基因沉默和基因功能研究方面有着广泛的应用。
通过合成特异性靶向基因的siRNA，可以有效地抑制目标基因的表达，从而研究基因功能。
此外，siRNA还可以用于寻找新的治疗方法，如抑制特定病原体的基因表达。
2. miRNA技术miRNA是内源性产生的小RNA分子，主要通过通过碱基互补与靶向mRNA结合，并通过RNA诱导靶向基因沉默复合物（RISC）介导靶向mRNA的降解或翻译抑制。
与siRNA不同，miRNA通过调控基因表达来调节细胞过程的正常功能。
miRNA技术在基因调控和疾病治疗中具有重要的作用。
研究发现，miRNA可以调控多种生物学过程，如细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡。
通过合成特定的miRNA类似物或抑制miRNA的表达，可以进一步了解miRNA的功能和调节机制，并可能用于治疗相关疾病。
6分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术（左图）和 大引物诱变法（右图），在基因序列中进行定点突变。
6.2 基因敲除技术
1、基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出 发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因 序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因 改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全 基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物 个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的 FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系 统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
ChIP不仅可以检测体内转录因子与 DNA的动态作用，还可以用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达 的关系。 定性或定量检测体内转录因子与 DNA的动态作用。 ChIP-chip and ChIP-seq：在基因 组水平研究DNA结合蛋白、组蛋白 修饰以及核小体分布。 ChIP-seq相对于ChIP-chip来说，具 有更高的分辨率、更小的噪音以及 更广的基因组覆盖范围。 Nucleosome Occupancy study: 一 些转录因子本身并不含有DNA结合 结构域，它是通过参与形成蛋白复 合物从而改变染色质结构来发挥作 用的；因此我们可以通过研究基因 组上核小体的分布变化来揭示转录 因子作用的过程。
基因功能缺失技术
基因功能缺失技术可以分为基因敲除 、基因沉默和基因敲减等不同类型， 每种技术有各自的特点和应用范围。
工作原理
基因敲除
通过同源重组或非同源末端连接 的方式，将特定基因从染色体上 删除或破坏，导致该基因无法正
常表达或发挥作用。
基因沉默
通过转录或翻译水平的抑制，使特 定基因的表达受到抑制或完全沉默 ，从而达到基因功能缺失的目的。
03
重要方面，以确保技术的合理应用和规范发展。
THANKS
谢谢您的观看
基础研究
基因沉默技术可用于研究特定基 因的功能，探索基因与疾病的关 系，为疾病治疗提供理论依据。
疾病治疗
基因沉默技术可用于治疗某些遗 传性疾病和肿瘤等重大疾病。例 如，针对某些致癌基因的siRNA 可抑制其表达，从而达到治疗肿
瘤的目的。
药物研发
基因沉默技术可用于筛选和验证 药物作用的靶点，加速新药研发
除、敲入或点突变的操作。
基因编辑技术的操作方法
设计特异性核酸酶是基因编辑技术的关键步骤 ，需要选择合适的靶点并确保核酸酶的特异性
。
将基因编辑载体导入细胞或生物体可以采用不同的方 法，如显微注射、电穿孔、脂质体转染等。
基因编辑技术的操作步骤包括设计特异性核酸 酶、构建基因编辑载体、将基因编辑载体导入 细胞或生物体等。
进程。
04
基因编辑技术
基因编辑技术的原理
基因编辑技术的基本原理是利用 核酸酶对DNA进行精准切割，从 而实现对特定基因的敲除、插入
或替换。
基因编辑技术主要依赖于人工核 酸酶，如CRISPR-Cas9系统，能 够高效、精准地识别和切割DNA
序列。
切割后的DNA可以通过同源重组 修复机制或非同源末端连接修复 机制进行修复，从而实现基因敲
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种革命性的生物工程工具，它利用细菌体内天然存在的免疫系统来精确修改基因。
自从2012年首次引入以来，CRISPR-Cas9已经被广泛用于改变生物学研究和医学治疗的方式。
本文将介绍CRISPR-Cas9的原理、应用方法，并总结其在不同领域的应用。
### CRISPR-Cas9的原理CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古生菌基因组中的DNA序列，它记录了它们所受到的外来病毒基因组的片段。
Cas9是CRISPR系统中的一种蛋白质，具有剪切DNA 的能力。
利用这种系统，科学家们成功将CRISPR-Cas9技术应用于编辑生物体的基因。
CRISPR-Cas9系统的工作原理如下：1. 选择目标基因：确定需要编辑的特定基因序列，并设计与其互补的RNA引导分子（sgRNA）。
2. sgRNA的结合：通过合成互补基因组DNA片段成为单链RNA，与Cas9蛋白结合成一个复合物。
3. 定位到基因组：CRISPR-Cas9复合物进入靶细胞，通过与目标基因的序列互补对应，定位到特定的基因位点。
4. 剪切DNA：Cas9蛋白通过剪切DNA的方式精确修改目标基因，形成双链断裂。
5. 修复机制介入：细胞自身的DNA修复机制介入，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式修复双链断裂。
6. 基因修复：通过修复机制，引入目标基因的缺陷或修复，实现基因编辑。
### CRISPR-Cas9的应用方法CRISPR-Cas9技术的应用方法主要包括基因敲除、基因敲入和基因打靶等。
下面将详细介绍这些方法：#### 1. 基因敲除基因敲除是指通过CRISPR-Cas9技术使目标基因完全失活。
其步骤如下：- 设计sgRNA：选择目标基因的外显子序列，设计与之相互配对的sgRNA。
基因功能分析的方法和原理
基因功能分析的方法和原理基因功能分析是研究基因在细胞内所起作用的一种方法。
它探究基因是如何影响生物的生理活动、发育过程和疾病表现的。
通过基因功能分析，科学家可以深入了解基因的调控机制，揭示基因在不同生物体系中的功能，并且有助于识别和理解疾病的基因变异。
基因功能分析的方法主要包括基因沉默、基因过表达和基因敲除等。
其中，基因沉默是指抑制基因的表达，减少或消除基因的功能。
常用的基因沉默技术有RNA 干扰（RNAi）和使用反义寡核苷酸技术。
RNAi 是一种通过介导mRNA的降解来抑制特定基因表达的机制。
通过合成双链小干扰RNA (siRNA) 或构建操纵RNAi的表达载体，可以选择性地降低目标基因的表达水平。
反义寡核苷酸技术则是设计成与目标基因的mRNA序列互补的寡核苷酸，以阻断其翻译或增加其降解，从而靶向抑制特定基因。
基因过表达是指增加特定基因的表达水平，以增加或改变基因的功能。
基因过表达的方法主要包括转基因技术、CRISPR/Cas9技术和表达载体介导的过表达等。
转基因技术通过把目标基因导入到特定生物体系中，使其在细胞内产生高表达。
CRISPR/Cas9技术则是一种高效且精准的基因编辑工具，可以实现基因的过表达。
表达载体介导的过表达则是通过构建含有目标基因的表达载体，并将其转染至细胞中，使细胞能够大量产生目标基因。
基因敲除是指在生物体内删除目标基因，观察敲除后生物体发生的变化。
常用的基因敲除技术有CRISPR/Cas9技术和选择性基因敲除技术。
CRISPR/Cas9技术通过设计合成特定的RNA与Cas9蛋白结合，形成RNA-Cas9复合物并导入到细胞中，从而切割目标基因的DNA序列，导致基因敲除。
选择性基因敲除技术则是通过设计引物，在细胞内产生剪切效应，并从整个基因组中获得目标基因的敲除。
基因功能分析的原理是基于对基因组、转录组和蛋白质组进行系统性的分析。
通过利用不同的技术手段，如DNA测序、RNA测序和质谱仪等，研究人员可以获得大量的基因和蛋白质的信息，进而了解它们的表达模式、功能等。
有哪些基因操作方法
有哪些基因操作方法
基因操作方法主要有以下几种：
1. 基因克隆：将感兴趣的基因从一个生物体中分离并放入另一个生物体中。
这常用于制备大量复制的基因，进行基因表达研究和生产蛋白质等。
2. 基因敲除：利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，针对目标基因进行定点突变或删除，使其失去功能。
这可以用于研究基因功能、治疗基因相关疾病等。
3. 基因插入：将外源基因插入到生物体的染色体中，使其表达并产生相关产物。
这通常用于生物技术和基因治疗研究。
4. 基因表达：通过转录、转译过程，使目标基因能够在目标生物体中产生蛋白质。
这常用于生物工程、基因治疗等。
5. 基因组编辑：利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，对整个基因组进行修改，如改变染色体结构、组织转基因植物等。
6. 基因修饰：通过同源重组或点突变等方法，对基因进行修改，如在特定位点添加或删减化学修饰或标签，以研究基因功能或改善基因表达。
需要注意的是，基因操作在不同生物体和研究领域之间可能有所不同，常用技术
和方法也会有所变化。
热点微专题13 基因组编辑技术(原卷版)
热点微专题13 基因组编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(SgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
【高考真题研究】1、(2021海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是。
(3)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是。
随后，Cas9蛋白可切割序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是，基因敲除成功的判断依据是。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。
科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
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（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
刘惠荣 内蒙古农业大学生命科学学院
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细
胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从
转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因
组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因
动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所
• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导 型基因敲除。 • 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个
体中的靶基因活性。
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空 间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动物
的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲 除的技术。
胞或发育的某一特定阶段
的一种特殊的基因敲除方 法。它实际上是在常规的
基因敲除的基础上，利用
重组酶Cre介导的位点特异 性重组技术，在对小鼠基 因修饰的时空范围上设置 一个可调控的“按钮”， 从而使对小鼠基因组的修 饰的范围和时间处于一种
可控状态。
Cre/胞遗传特性的目的。
• 传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随 机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于 10-6），增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠 模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技 术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限
制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定
阶段的一种特殊的基因敲除方法。 • 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。 • 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统
和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（三）诱导型基因敲除
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统
为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性 或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点， 通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物 的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定 基因的敲除。
• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛 应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时 空特异性基因打靶策略的技术核心。
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超
基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp （EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。 Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。它 不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被 删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何 辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环 状甚至超螺旋 DNA。
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
• Cre-LoxP系统的特性
条件性基因敲除法可定义 为将某个基因的修饰限制 于小鼠某些特定类型的细
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及 疾病发生、治疗过程中的作用和机制 这一技术亦存在一些缺点：
1. 费用太高
2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这 些基因的功能为其他基因代偿所致
Cre-LoxP重组酶系统
• LoxP（locus ofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是
有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成， 8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化 DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序 列是Cre酶的结合域。其序列如下 ：