流式细胞仪的原理介绍

（2）光 学 系 统 由激光光源、分色反光镜、光束成形 器、透镜组、滤片和光电倍增管组成。
Flow Tip SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数 据 处 理 系 统
主要由计算机和及其软件（BD FASCDiva和BD ModFit LTTM）组成。
流式细胞仪与显微镜的区别
单参数直方图
量细 胞 相 对 数
信道 (channel )
2.双 参 数 直 方 图

双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细 胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确 定细胞在图上的表达位臵。
双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点 密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利 用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒 数量的多少。
1.单细胞悬液制备的质控



适当的制备方式 实体组织来源标本用机械法 温度25-37℃，pH7.0-7.2
2. 免疫荧光染色的质控



温度 pH 染料浓度 固定剂
3. 仪器操作的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状 态，减少变异（CV）。

PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最 佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。
线粒体跨膜电位降低 (Rhodamine123） 膜磷脂酰丝氨酸外化(Annexin V-FITC/PI) Ca2+ 浓度升高 (Fluo-3） DNA断裂及含量的变化 (TUNEL 和 PI）
FCM 检 测 细 胞 凋 亡 的 特 点
FCM能鉴别及定量分析凋亡细胞， 揭示凋亡相关的分子及其功能机制，测 定凋亡细胞功能特征的变化，并能对细 胞的多个特征同时进行多参数测量，还 具有简便、快速、检测所需细胞量少等 优点 .

Peng zhang; Free Radical Research,2009,43(3):224-233.
细 胞 凋 亡 的 检 测

细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest
33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）


Caspases激活(Caspase-3 )
PI染色检测细胞周期 Protocol



离心收集细胞，弃上清，用PBS洗细胞两次。 加入预冷的70%乙醇，于40C固定过夜，或-200C长期固 定。 细胞染色：离心收集细胞，用1mlPBS洗细胞一次，加 入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙锭（PI）， 100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40C避光孵育30 分钟。 流式细胞仪检测：一般细胞计数2-3万个。结果用软件 Modfit分析。
荧光染料的特性 •激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧 光 信 号 的 检 测

使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量
四、细 胞 分 选 原 理
通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对 具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进 行的。
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果 流式细胞仪 激光 细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机 多参数，综合分析 光学显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等 载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工 简单，单参数
二、散 射 光 的 测 量
细胞在液柱中与激光束相交时向 周围360°立体角方向散射的光线信 号，它的强弱与细胞的大小、形状、 胞内颗粒折射等有关，主要分为前向 散射光和侧向散射光。
Annexin-V 和 PI 双 染 protocol



细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液 （binding buffer）中以1 x 106 细胞/mL的 浓度重悬 吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。 加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。 混匀后避光室温下孵育15分钟。（必须在室温 下进行） 孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细 胞仪分析。
细 胞 分 选 示 意 图
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动 流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
不充电 弃去
五、数 据 的 显 示 与 分 析

参数：FS,SS,FL
数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点 图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数 散点图 ） 设门分析技术
前 向 散 射 光 示 意 图
Laser
FALS Sensor
侧 向 散 射 光（SS） 侧向散射光（side scatter, SS）： 激光束照射细胞时，光以90°角散射 的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
侧 向 散 射 光 示 意 图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
Modfit LT 分 析 细 胞 周 期
细 胞 周 期 结 果 分 析

CV值：又称为变异系数，一般CV值越小， 峰型越好，越尖锐。能控制在5%左右是比 较好的结果，一般小于10%就可以认可了。
G2/G1为1.82.（即G2期是四倍体细胞，而 G1期是二倍体细胞，比值应为1.8-2.0之 间。若小于1.8，则细胞染色不充分。
待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标 记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样 品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位臵，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。

液 流 系 统 示 意 图
液流速度：低速、中速、高速
低速：10ul/min; 中速：60ul/min; 高速：120ul/min.

培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 洗涤 尼龙网过滤
使贴壁细胞脱落
单细胞悬液的制备与保存


新鲜实体组织单细胞悬液的制备
机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 Nhomakorabea

单细胞悬液的保存
深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
（二）常 见 的 荧 光 染 料
藻青蛋白
别藻青蛋 白 能量传递 复合染料
PC
APC PEcy5
488
633 488
（三）免 疫 荧 光 标 记

荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合

免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体
（三）流式细胞免疫学技术的质量控制

4. 免疫检测的质控

同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同 源性的未标记单抗作为对照调整和设臵电压，以保证
特异性。（通常采用未染色细胞作为阴性对照）

全程质量控制：同型对照与待测标本一起标记和检测， 该实验结果可靠。
七、流 式 细 胞 仪 的 科 研 应 用



树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究 流式细胞术在免疫检验中的应用

双参数直方图点图
度红 色 荧 光 强
绿色荧光强 度
（三）设 门 分 析 技 术
1.Gate设臵：指根据该图的细胞群分布
选定其中想要分析的特定细胞群。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多 边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均为 任意门
线性门
名称 异硫氰酸 荧光素 得州红 藻红蛋白 染料 FITC Texas red PE 激发 波长 488 568 488 荧光 颜色 绿 525 红 615 橙 575 易 红 670 红 670 易 不敏感 不敏感 具较多发光基团， 消光系数和量子产 额高 减少交叉，成本高 溶解性 易 不易 对PH敏 感性 敏感 不敏感 特点 易溶于水，与抗体 结合不影响特异性 稳定，偶联后量子 产额低
2. 区阈（Region设置）:
如十字门分析时，由四个 区阈构成，即 G=D1+D2+D3+D4。
D1：CD4+/CD3D2：CD4+/CD3+ D3：CD4- /CD3D4：CD4- /CD3+
六、流式细胞仪免疫分析的技术要求

样本制备 标记染色 质量控制
（一）免 疫 样 品 的 制 备 单细胞悬液
流式细胞仪的原理及应用
马黎明 生命科学与技术学院
流式细胞术的基本概念
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以 流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精
确的对单个细胞理化特性（如大小、内部
结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行
多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞 及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状 态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上 获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分 选。

（一）参 数 说 明
FS：反映颗粒的大小
SS：反映颗粒的内部结构复杂程度
FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
（二）数 据 显 示 方 式
直分析方图



单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析
1.单 参 数 直 方 图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保 证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个 参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计 分析精确性。


1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液 流 系 统

由样本和鞘液组成
FCM 在 细 胞 生 物 学 中 的 应 用
DNA 细 胞 周 期 分 析
G1
S (DNA synthesis)
M (mitosis)
G2
细 胞 周 期（cell cycle）
G1期(DNA合成前期) 从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，此期主 要合成RNA和核糖体。
S 期(DNA合成期) 除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制 所需要的酶都在这一时期合成。 G2期(DNA合成后期) 大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟 因子等。 M期（细胞分裂期）由一个母细胞分裂成为两个子细胞 。 G0期（细胞休眠期）暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一 定生物学功能的细胞所处的时期 。
光散射测量的用途
测得的FS与SS信号 通过计算机处理，可得 到FS-SS图，由此可仅 用散射光信号对未染色 的活细胞进行分析或分 选。 此为血细胞分类的基 本原理，但不能分析表 面分子。 光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧 光 的 测 量



荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料 受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长 不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色， 通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散 射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增 管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞 上的多个不同特征。
细胞结构 • 细胞大小 • 细胞颗粒度 • DNA含量与细胞周期 • RNA含量 • 蛋白质含量 • …… 细胞功能 · 细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原 · 细胞活性 · 细胞内/外的细胞因子 · 激素结合位点 · 细胞受体 · 钙离子浓度 · 线粒体膜电位 · ……
一、流式细胞仪的工作原理

采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与 激发效率；
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞仪的基本概念
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强 度的细胞分析仪，是集激光技术、电子物理技 术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧 光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新 型高科技仪器。
BD FACSCanto流式细胞分析仪
流式细胞仪的检测范围
前 向 散 射 光（FS） 前向散射光（forward scatter, FS）： 激光束照射细胞时，光以相对轴较小角 度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检 测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与 细胞体积大小成正比。
通常在FCM应用中，选取FS作阈值，来排除样品中的各种 碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。