乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析

方法学验证

姓名 Z P

学号 0925400072

班级 09级医学检验本科二班

指导老师沈富兵

二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）

【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。

【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA

病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。

我们采用对已知抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂盒

乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。

1.1.2 仪器及酶标板

酶标仪：Bio-Rad 680；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix；

电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。

1.1.3 溶液配制

⑴0.01M pH7.4的PBS缓冲液：

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

⑵质控品：

用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。

首先取450μl 的8ng/ml 的标准品到C1号EP 管中再向其中加入150μl 的PBS 缓冲液，即配制成了6ng/ml 的质控品，再取300μl C1号EP 管内的溶液到C2号EP 管内，再向C2号管内加入300μl 的缓冲液混匀。即配制成了3ng/ml 的质控品。接着取300μl C2号管内的液体到C3号EP 管内，再加入300μl 的缓冲液混匀，即配制成了1.5ng/ml 的质控品。具体方法如下图1

图1

1.2 检测方法

1.2.1 标准曲线各浓度的配制

⑴用PBS 缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml 。 ⑵先取6个EP 管分别标记为对应的浓度。

⑶取400μl 标准品于标记为①的EP 管中，再取200μl ①号管内液体于②号管内再向②号管中加入200μl 的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml 的标准品。 ⑷再从②号管内取200μl 的液体到③号管内，接着取200μl 的缓冲液到③号管内混匀，即配制成了2ng/ml 的标准品。

⑸从③号管内取200μl 的标准品到④号管内，再向④号管内加入200μl 的缓冲液混匀，即配制成了1ng/ml 的标准品。

⑹用同样的方法，配制好浓度分别为0.5ng/ml 、0.25ng/ml.的标准品体积分别为200μl 、200μl 、400μl 备用。具体方法如下图2

图2

1.2.2 测定方法

⑴取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中加入已配制好的系

列标准品、质控品及空白对照；

C3 1.5ng/ml

C2 3ng/ml

C1 6ng/ml

S6 0.25ng /ml

S5 0.5ng/ml

S4 1ng/ml

S3 2ng/ml

S2 4ng/ml

S1 8ng/ml

8 8 6 3 1.5 ○-

4 4 6 3 1.

5 ○-

2 2 6

3 1.5 ○-

1 1 6 3 1.5 ○-

0.5 0.5 6 3 1.5 ○-

0.25 0.25 ○-

○-○-○-○-

○-○-○-○-

图3

注：双线框区域为标准品,浓度依次为8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三线框区域为质控品，浓度依次为6、

3、1.5ng/ml，粗框区域为空白对照加入的是PBS缓冲液，每个孔内加入的均是50μl。

⑵37℃温育30min，洗板4次；

⑶加入酶标抗体，生物素二抗，50μl/孔；

⑷37℃温育30min，洗板4次；

⑸加入A、B液，50μl/孔，37℃温育15分钟；

⑹加入终止液，50μl/孔。

1.3 标准曲线制作及结果计算

⑴酶标板放入酶标仪，盖上盖子；

⑵在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件；

⑶选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值；

⑷输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值，打印标准曲线图和计算结果。

1.4 统计学方法

用Microsoft Excel处理实验数据。

2 结果

2.1 测得的OD值如下表