实时荧光等温扩增技术
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
环介导等温扩增技术(LAMP)
学生： 罗乐 指导老师：聂凯老师
2000年，日本学者Notomi 等发明了一种全新的 核酸扩增方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ，LAMP)。该法能在等温条 件下高特异，高灵敏的扩增DNA。其特点是针对靶 基因的六个区域设计4种特异性引物，利用一种链 置换DNA聚合酶在等温条件（65℃左右）保温一小 时，即可完成核酸扩增反应。
引物设计
Primer Explo来自百度文库er version 4.0 软件
扩增机制
1.循环扩增始发物的形成
2.循环延伸
操作程序
DNA模板：首先将模板DNA、引物、dNTP 和缓 冲液按比例配制, 混匀后置95℃中5min( 参与反应 的模板仍然是未变性的DNA) ; 然后冰浴5～10min 退火; 而后加入适量的BstDNA 聚合酶, 于60℃～ 65℃反应, 移至80℃热浴10min 终止反应。
RT-LAMP不会受到提取RNA过程中的污染 物的限制，该文献提示现行的核酸提取方法 过于复杂，需要开发更简单的程序。
疟原虫的检测
在该文献中，研究者直接将50uL的血液在99℃加热十 分钟，然后吸取2uL上清液直接做LAMP 。为了验证这种 方法，研究者又提取这些样本的DNA，并进行了PCR。
PCR(DNA提 LAMP（裂 sensitivity
60℃2小时 (LA-200) 40cycles
条件同上
阳性对照组（含有待测基因的拷贝数已知的质粒）
临床样本
浊度 亮度
阳性样本
阴性样本
含待测基因的 质粒阳性对照
应用
LAMP 法已经被广泛应用于动物胚胎性别 鉴定，人、动物和植物致病微生物以及寄生 虫的检测，转基因食品，疾病基因诊断，环 境监测食品卫生检疫及基因芯片的开发。
现在日本Eiken公司网站www．eiken．co．jp／en／ index．html已经开发了包括禽流感、SARS、西尼罗河病 毒、牛胚胎性别检测等19种LAMP检测产品试剂盒出售
国内也报道研制出沙门氏菌、副溶血弧菌、大肠杆 菌O157等的快速检测试剂盒。
RNA模板：只需在里面加入逆转录酶即可反应。
RT-LAMP扩增FMDV结果的检测方法
LAMP能扩增1-10个拷贝的起始模板浓度 ；RT-LAMP的灵敏度比end-point RT-PCR高10 倍，比常规RT-PCR高10-100倍。从反应速度来 看，RT-LAMP胜过于TaqMan-RT-PCR,而且利用 将96孔板放在实时热循环仪上操作，可以实 现样本的高通量检测。
取物)
解上清液） specificity
101(+)
96(+)
95%
101(-)
100(-)
99%
LAMP(裂解上 清液)
13（+）
PCR（裂解上 清液
7（+）
PCR（DNA提 取物
13（+）
因此，LAMP不需要抽提纯化DNA就可以进行DNA的高效扩 增，它明显的降低了成本和循环时间;而且LAMP具有较强的 抗干扰能力，可能是由于Bst DNA Polymerase的缘故。
学生： 罗乐 指导老师：聂凯老师
2000年，日本学者Notomi 等发明了一种全新的 核酸扩增方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ，LAMP)。该法能在等温条 件下高特异，高灵敏的扩增DNA。其特点是针对靶 基因的六个区域设计4种特异性引物，利用一种链 置换DNA聚合酶在等温条件（65℃左右）保温一小 时，即可完成核酸扩增反应。
引物设计
Primer Explo来自百度文库er version 4.0 软件
扩增机制
1.循环扩增始发物的形成
2.循环延伸
操作程序
DNA模板：首先将模板DNA、引物、dNTP 和缓 冲液按比例配制, 混匀后置95℃中5min( 参与反应 的模板仍然是未变性的DNA) ; 然后冰浴5～10min 退火; 而后加入适量的BstDNA 聚合酶, 于60℃～ 65℃反应, 移至80℃热浴10min 终止反应。
RT-LAMP不会受到提取RNA过程中的污染 物的限制，该文献提示现行的核酸提取方法 过于复杂，需要开发更简单的程序。
疟原虫的检测
在该文献中，研究者直接将50uL的血液在99℃加热十 分钟，然后吸取2uL上清液直接做LAMP 。为了验证这种 方法，研究者又提取这些样本的DNA，并进行了PCR。
PCR(DNA提 LAMP（裂 sensitivity
60℃2小时 (LA-200) 40cycles
条件同上
阳性对照组（含有待测基因的拷贝数已知的质粒）
临床样本
浊度 亮度
阳性样本
阴性样本
含待测基因的 质粒阳性对照
应用
LAMP 法已经被广泛应用于动物胚胎性别 鉴定，人、动物和植物致病微生物以及寄生 虫的检测，转基因食品，疾病基因诊断，环 境监测食品卫生检疫及基因芯片的开发。
现在日本Eiken公司网站www．eiken．co．jp／en／ index．html已经开发了包括禽流感、SARS、西尼罗河病 毒、牛胚胎性别检测等19种LAMP检测产品试剂盒出售
国内也报道研制出沙门氏菌、副溶血弧菌、大肠杆 菌O157等的快速检测试剂盒。
RNA模板：只需在里面加入逆转录酶即可反应。
RT-LAMP扩增FMDV结果的检测方法
LAMP能扩增1-10个拷贝的起始模板浓度 ；RT-LAMP的灵敏度比end-point RT-PCR高10 倍，比常规RT-PCR高10-100倍。从反应速度来 看，RT-LAMP胜过于TaqMan-RT-PCR,而且利用 将96孔板放在实时热循环仪上操作，可以实 现样本的高通量检测。
取物)
解上清液） specificity
101(+)
96(+)
95%
101(-)
100(-)
99%
LAMP(裂解上 清液)
13（+）
PCR（裂解上 清液
7（+）
PCR（DNA提 取物
13（+）
因此，LAMP不需要抽提纯化DNA就可以进行DNA的高效扩 增，它明显的降低了成本和循环时间;而且LAMP具有较强的 抗干扰能力，可能是由于Bst DNA Polymerase的缘故。