蛋白质分离技术层析
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指混合物随流动相经固定相的层析柱时， 混合物中各组份按其分子大小不同而被分离 的技术。
一、基本原理
固定相（凝胶）A good gel for
gel filtration
——三维空间网状结构
contains about
95% water
■ 凝胶层析法：
分子筛效应：
分子大小不同, 在凝胶受到的 阻滞作用有差 异,从而造成各 组分在凝胶柱 中的迁移速度 不同得到分离。 小分子
1970s早期 高效液相色谱法（HPLC)
目前 气相层析仪和HPLC与色谱、质谱以及计算机 联用。
层析法进行时有两个相，一个相 称为固定相，另一相称为流动相。
支持物
含待分离物质
二.层析技术的分类
1. 按两相所处的状态分类
气
气-固
相 以气体作为流动相
层
气-液
析
液
相
液-固
以液体作为流动相
层
液-液 析
一、概述
1、定义 层析(又名色谱)
一种利用混合物 中各组分的物理化学 性质间的差异，使各 组分在层析两相中以 不同程度分配，借此 将各组分分离。
2、物理化学性质间的差异
分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力 分子亲和力 吸附能力
凝胶层析
离子交换层析 亲和层析
吸附层析
3、层析的发展
1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物 色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;
溶质在流动相中的浓度 Cm
⇋特定的温度：常数 ⇋K大：被固定相吸附的牢固，随流动相
的移动速度较慢。
纯化生物物质的纯度
取决于混合物中各组分K 值的差异 程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易地把混合物中的生物物质分 离。反之,K值相差较小,不易把混合物 中的生物物质分离。
凝胶层析
Gel Chromatography
2.按层析的机制可分为
吸附层析 分配层析 凝胶层析 亲和层析 离子交换层析
（1）吸附层析
定义
原理
指混合物随流动相通过 吸附剂时，由于吸附剂
在不同条件下，吸附剂 与被吸附物之间的作用
对不同物质的吸附力而 物理作用的范德华吸附：无
使混合物分离的方法。 选择性，吸附速度快，吸
被延滯
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
较快流出
凝胶层析过程的数理关系
1、柱床体积(VT) 2、洗脱体积（Ve） 即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱
液的总体积。 3、外水体积（V0） 4、内水体积（Vi） 5、凝胶干体积（Vg）
数理关系
外水体积V0
存在于柱床内凝胶 外面空隙之间的水 相体积，相应于一 般层析法中流动相 的体积。
凝胶过滤 （gel filtration）(Porath, Flodin, 1959) 分子筛层析（molecular sieve chromatography）
(Hjertén, Mosbach, 1962)
排阻层析 （exclusion chromatography）(Pedersen,
1962)
动相里,
为1,最后流出.
最先流出。
(3) 0 <Kd <1 Ve = Vo +ViKd
•为溶质以某种程 度向凝胶颗粒内扩 散
Kd=0 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
三.凝胶层析的优点 四、凝胶层析的缺点
1.凝胶是一种不带电 1.要求样品和洗脱液的 荷的惰性载体，结 粘度很低。
构稳定。
2.凝胶颗粒网络孔径大
2. 操作条件较温和 。 小 非 常 有 限 , 所 以 可
3. 样 品 得 率 高 , 重 复 被纯化的物质的分子
性好,可进行大量样 量范围受到限制。
品的分离纯化。
3.凝胶结构对某些溶质
分子具有吸附作用。
五、凝胶的结构 与性能
1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成 （商品名为Sephadex） （1）结构： 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构。
凝胶干体积Vg 内水体积Vi
柱床体积VT
颗粒内部所含水相 的体积它可从干凝 胶颗粒重量和吸水 重量相减求得。
凝胶体积以及颗粒内 外间隙体积的总和。
VT = 1/4 D2h VT = Vg + V0 + Vi
6、分配系数（ Kd ）：
每个溶质分子在流动相和固定相之间有一 个特定的分配系数（Kd）
Ve=Vo+KdVi
附的过程是可逆的
化学吸附：由原子价力的作 用引起。有选择性，吸附 速度较慢，不易解吸
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和 同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡， 吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。
吸附层析
常用的吸附剂
硅胶
氧化铝
碱性:碳氢化合物 中性:醛,酮,醌,酯,内酯 酸性:酸性色素,醛,酸
（2）特点：
交联度： 交联剂越多
交联度越大 网孔结构越紧密 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松
化学性质：
稳定,不溶于水、 盐、弱酸、碱和 一般有机溶剂, 耐热耐碱不耐强 酸
（2）特点：
Sephadex的分级范围
G10 <700 G15 <1,500 G25 1,000 ~ 5,000 G-50 1,500~30,000 G-75 3,000~70,000 G100 4,000 ~150,000 G150 5,000 ~400,000 G200 5,000 ~800,000
柱层析 进样量大且容易回收
薄层层析 小量样品，快速， 操作简便
■ 层析法的演变过程：
圆形滤纸
长条滤纸
加展开液
柱层析
薄层层析 (TL来自百度文库)
容量变大
容量更大
纸层析
薄层层析
三.层析的一般原理
1.分配系数 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定 相）中分配程度。
溶质在固定相中的浓度 Cs
K= ———————————— = ——
活性炭
粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱
聚酰胺
锦纶66或锦纶6 酰胺基团 对酚,DNP-氨基酸, 醌,羧酸 氢键：羟基与羰基
磷酸钙
唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石
（2）分配层析
——利用不同组分在流动相和固定相中的分配 系数不同而进行分离的方法。
3.按制备量分类
Ve -Vo Kd = ————
Vi
特点： （1）与被分离物质分 子的大小和凝胶颗粒 孔隙的大小有关 （2）与柱的长短粗细 无关
(1)Ve = Vo
(2)Ve = Vo + Vi
Kd = 0
Kd = 1
分子完全被排 分子完全不被排阻
阻 于 凝 胶 颗 粒 完全向凝胶颗粒内
之外
部扩散
全部分布于流 在两相分配的比值
一、基本原理
固定相（凝胶）A good gel for
gel filtration
——三维空间网状结构
contains about
95% water
■ 凝胶层析法：
分子筛效应：
分子大小不同, 在凝胶受到的 阻滞作用有差 异,从而造成各 组分在凝胶柱 中的迁移速度 不同得到分离。 小分子
1970s早期 高效液相色谱法（HPLC)
目前 气相层析仪和HPLC与色谱、质谱以及计算机 联用。
层析法进行时有两个相，一个相 称为固定相，另一相称为流动相。
支持物
含待分离物质
二.层析技术的分类
1. 按两相所处的状态分类
气
气-固
相 以气体作为流动相
层
气-液
析
液
相
液-固
以液体作为流动相
层
液-液 析
一、概述
1、定义 层析(又名色谱)
一种利用混合物 中各组分的物理化学 性质间的差异，使各 组分在层析两相中以 不同程度分配，借此 将各组分分离。
2、物理化学性质间的差异
分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力 分子亲和力 吸附能力
凝胶层析
离子交换层析 亲和层析
吸附层析
3、层析的发展
1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物 色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;
溶质在流动相中的浓度 Cm
⇋特定的温度：常数 ⇋K大：被固定相吸附的牢固，随流动相
的移动速度较慢。
纯化生物物质的纯度
取决于混合物中各组分K 值的差异 程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易地把混合物中的生物物质分 离。反之,K值相差较小,不易把混合物 中的生物物质分离。
凝胶层析
Gel Chromatography
2.按层析的机制可分为
吸附层析 分配层析 凝胶层析 亲和层析 离子交换层析
（1）吸附层析
定义
原理
指混合物随流动相通过 吸附剂时，由于吸附剂
在不同条件下，吸附剂 与被吸附物之间的作用
对不同物质的吸附力而 物理作用的范德华吸附：无
使混合物分离的方法。 选择性，吸附速度快，吸
被延滯
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
较快流出
凝胶层析过程的数理关系
1、柱床体积(VT) 2、洗脱体积（Ve） 即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱
液的总体积。 3、外水体积（V0） 4、内水体积（Vi） 5、凝胶干体积（Vg）
数理关系
外水体积V0
存在于柱床内凝胶 外面空隙之间的水 相体积，相应于一 般层析法中流动相 的体积。
凝胶过滤 （gel filtration）(Porath, Flodin, 1959) 分子筛层析（molecular sieve chromatography）
(Hjertén, Mosbach, 1962)
排阻层析 （exclusion chromatography）(Pedersen,
1962)
动相里,
为1,最后流出.
最先流出。
(3) 0 <Kd <1 Ve = Vo +ViKd
•为溶质以某种程 度向凝胶颗粒内扩 散
Kd=0 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
三.凝胶层析的优点 四、凝胶层析的缺点
1.凝胶是一种不带电 1.要求样品和洗脱液的 荷的惰性载体，结 粘度很低。
构稳定。
2.凝胶颗粒网络孔径大
2. 操作条件较温和 。 小 非 常 有 限 , 所 以 可
3. 样 品 得 率 高 , 重 复 被纯化的物质的分子
性好,可进行大量样 量范围受到限制。
品的分离纯化。
3.凝胶结构对某些溶质
分子具有吸附作用。
五、凝胶的结构 与性能
1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成 （商品名为Sephadex） （1）结构： 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构。
凝胶干体积Vg 内水体积Vi
柱床体积VT
颗粒内部所含水相 的体积它可从干凝 胶颗粒重量和吸水 重量相减求得。
凝胶体积以及颗粒内 外间隙体积的总和。
VT = 1/4 D2h VT = Vg + V0 + Vi
6、分配系数（ Kd ）：
每个溶质分子在流动相和固定相之间有一 个特定的分配系数（Kd）
Ve=Vo+KdVi
附的过程是可逆的
化学吸附：由原子价力的作 用引起。有选择性，吸附 速度较慢，不易解吸
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和 同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡， 吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。
吸附层析
常用的吸附剂
硅胶
氧化铝
碱性:碳氢化合物 中性:醛,酮,醌,酯,内酯 酸性:酸性色素,醛,酸
（2）特点：
交联度： 交联剂越多
交联度越大 网孔结构越紧密 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松
化学性质：
稳定,不溶于水、 盐、弱酸、碱和 一般有机溶剂, 耐热耐碱不耐强 酸
（2）特点：
Sephadex的分级范围
G10 <700 G15 <1,500 G25 1,000 ~ 5,000 G-50 1,500~30,000 G-75 3,000~70,000 G100 4,000 ~150,000 G150 5,000 ~400,000 G200 5,000 ~800,000
柱层析 进样量大且容易回收
薄层层析 小量样品，快速， 操作简便
■ 层析法的演变过程：
圆形滤纸
长条滤纸
加展开液
柱层析
薄层层析 (TL来自百度文库)
容量变大
容量更大
纸层析
薄层层析
三.层析的一般原理
1.分配系数 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定 相）中分配程度。
溶质在固定相中的浓度 Cs
K= ———————————— = ——
活性炭
粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱
聚酰胺
锦纶66或锦纶6 酰胺基团 对酚,DNP-氨基酸, 醌,羧酸 氢键：羟基与羰基
磷酸钙
唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石
（2）分配层析
——利用不同组分在流动相和固定相中的分配 系数不同而进行分离的方法。
3.按制备量分类
Ve -Vo Kd = ————
Vi
特点： （1）与被分离物质分 子的大小和凝胶颗粒 孔隙的大小有关 （2）与柱的长短粗细 无关
(1)Ve = Vo
(2)Ve = Vo + Vi
Kd = 0
Kd = 1
分子完全被排 分子完全不被排阻
阻 于 凝 胶 颗 粒 完全向凝胶颗粒内
之外
部扩散
全部分布于流 在两相分配的比值