酶工程 第九章 酶分子修饰

化学修饰的专一性
3. 动力学参数法
pH-酶活力关系的研究，可得到参与反应的必需 基团的pK值，通过比较分析估计基团的种类。
4. 蛋白质工程
将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达 一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可 知被置换的氨基酸是否为活力所必需。
第二节 酶分子修饰的目的和原理
（2）侧链基团修饰（小分子修饰 ）P141
（side residues modification）
通过化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变，从而改 变酶的催化特性的修饰方法。
侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主 要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基等。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧 链易被修饰，它们一般具有亲核性。
降低或消除酶蛋白的抗原性
酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 遮盖了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
⑥大分子结合修饰的应用
PEG-超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD） PEG-溶血类蛋白质（链激酶Streptokinase, SK; 尿激酶urokinase, UK等） PEG-天门冬酰胺酶（Asparaginase, ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 用Dextran修饰-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、 过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。
1. 通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然 酶的活性。——蛋白质水平
2. 通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达 到改造酶的目的。——核酸水平
酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结 构发生改变，从而改变酶的催化特性的技术。
主要内容
知识回顾：酶的活性中心 酶分子修饰的目的 酶分子修饰的种类 修饰酶的化学性质 酶分子修饰的应用
▪ 临床应用：延缓人体衰老，防止色素沉着，消除 局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发 性关节炎及辐射防护。
▪ 缺陷：半衰期短、稳定性差、免疫原性。
SOD作用机制
修饰方法
▪ 修饰剂选择：单甲氧基PEG (mPEG) ▪ 修饰剂活化：烷基化 ▪ 修饰：活化后的修饰剂与蛋白上赖氨酸残基的ε-
意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为 血浆增容剂 ▪ 修饰方法：戊二醛法、活性酯法
⑤大分子结合修饰的作用
提高酶的催化效率
水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合后，一 定程度上改变了酶的空间构象，有利于活性中 心与底物结合并发挥催化作用
增强酶的稳定性
增强酶天然构象的稳定性与耐热性——修饰剂与 酶形成多点交联，使酶的天然构象 “刚性”增加。 保护酶活性部位与抗抑制剂——大分子修饰剂产 生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂。 维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶——大 分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶；敏感基 团交联上修饰剂后受蛋白水解酶破坏的可能性减小。 稳定酶的微环境——大分子修饰剂（多聚电荷体） 在酶分子表面形成“缓冲外壳”
为20000，是一种含硫酸酯的黏多糖。 ▪ 经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以
提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血 脂等活性。 ▪ 修饰方法：三氯三嗪法、溴化氰法
④ 天然大分子对酶的修饰反应
人血清白蛋白： ▪ 包含585个氨基酸，分子量为66kD ▪ 临床应用：治疗休克与烧伤，用于补充因手术、
酶分子修饰
Modification of Enzyme Molecule
限制酶大规模应用的原因
1. 易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）； 2. 容易受产物和抑制剂的抑制； 3. 底物不溶于水，或酶的米氏常数过高； 4. 酶做为药物在体内的半衰期较短； 5. 已知酶种类及产物有限。
改变酶特性的两种主要方法
(4) 聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98,000的聚顺丁烯二酸 酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。
(5) 聚氨基酸：用分子量为5,700的聚赖氨酸做修饰剂 时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交 联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可 以与酶发生反应。
④ 天然大分子对酶的修饰反应
肝素 由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范 围（上世纪70年代）
1. 提高酶的生物活性（酶活力） 2. 增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期） 3. 消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力） 4. 产生新的催化能力
第三节 酶分子修饰的种类
一、金属离子置换修饰 二、酶分子的化学修饰 三、酶分子的物理修饰
氨基或N末端氨基反应，形成稳定的连接体 ▪ 分离：凝胶层析 ▪ 效果：抑制免疫反应的产生，提高抗酶水解能力，
延长半衰期
修饰原理
▪ PEG与蛋白的非必需基团结合后，分子表面形成 一个PEG保护层，作为一种屏障挡住蛋白分子表 面的抗原决定簇，避免抗体的产生或者阻止抗原 和抗体的结合而抑制免疫反应的产生。
利用水溶性大分子与酶的侧链基团结合，使酶的空 间结构发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。
修饰剂：
聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素 （heparin）、糖肽（glycopeptide）等。
修饰方法：
修饰剂选择，修饰剂活化，修饰，分离。
① 聚乙二醇的修饰反应
▪ 聚乙二醇（PEG， Mw 1000-10000）：线性大分子， 具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、 无残留、无免疫原性。
NH 2
NH
OH
2. 活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。
3. 活性部位是一个三维实体。
The active site is often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.
▪ 单甲氧基聚乙二醇（MPEG）： CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
▪ 修饰方法：重氮法、叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均 三嗪法。
重氮法
叠氮法
琥珀酸酐法
三氯三嗪法
例：聚乙二醇化学修饰超氧化物歧化酶（SOD）
▪ 超氧化物歧化酶(SOD)：生物体内重要的自由基 清除剂，催化超氧阴离子(O2-)的歧化反应，能缓 解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织缺血 性损伤，预防和治疗辐射损伤。
一、 酶分子修饰的目的 1. 研究酶的结构与功能的关系（上世纪50年代） • 探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 • 酶蛋白一级结构的测定 • 酶蛋白的结构变化与运动 • 酶蛋白部分区域的构象状态 • 酶的作用机理与催化反应历程 • 酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态 • 酶的固定化技术 • 酶纯度的分析与检测
③ 其他合成大分子多聚物的修饰反应
(1) 聚N - 乙烯吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量为 10,000的PVP，经过开环水解活化后，与酶结合。
(2) 聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝 基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧 基共价连接。
(3) 聚丙烯酸(PAA):用分子量为250,000的PAA，经过N - 羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。
The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product.
非必需基团
酶
非活性中心
▪ 由于这种保护层的形成保护了该酶免受体内水解 酶的消化，表现了较强的抗酶水解能力。
▪ 蛋白经PEG修饰后分子量增加，分子的体积增大， 肾小球过滤减少，可以避免被肾脏很快地排除， 因而其血浆存留时间得到显著延长，有助于蛋白 药物循环半衰期的延长。
② 糖类的修饰反应： 右旋糖苷修饰反应 ▪ 右旋糖苷： -葡萄糖通过 -1, 6-糖苷键连接而成，
2. 化学修饰法
根据所用修饰试剂不同，分为:
1) 非专一性化学修饰
用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 若修饰后：
酶活性不变——修饰基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失——修饰基团可能是酶的必需基 团，但不能确定是否同活性中心内的必需基团结合。
2) 专一性化学修饰
基团专一性修饰
侧链基团修饰剂：小分子化合物
根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。 非极性R基氨基酸（共9种）：
甘氨酸 (Glycine, Gly, G) 丙氨酸 (Alanine, Ala, A) 亮氨酸 (Leucine, Leu, L) 缬氨酸 (Valine, Val, V) 异亮氨酸 (Isoleucine, Ile, I) 苯丙氨酸 (Phenylalanine, Phe, F) 脯氨酸 (Proline, Pro, P) 色氨酸 (Tryptophan, Trp, W) 甲硫氨酸 (Methionine, Met, M)
分
子
活性中心外
必需基团
必需基团
结合基团 活
活性中心
性
必需基团 催化基团
中 心
活性中心的重要化学基团
7种氨基酸出现的频率最高: Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr、Ser
某些功能基团（如氨基、羧基、巯基、咪唑基和羟 基）是酶的必需基团。
O
O
H2N CH C OH
OH
H2N CH C OH O
4. 活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 5. 酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用
等次级键结合。
三、研究酶活性中心的方法
1. 物理学方法 2. 化学修饰法 3. 动力学参数法 4. 蛋白质工程
1. 物理学方法
用X射线衍射法直接检 测底物或其类似物与酶 形成的中间复合物（包 括酶和底物）的相对位 置。
用专一性化学修饰剂修饰酶分子中的某一特定氨 基酸残基的侧链基团。
位点专一性修饰 (亲和标记）
利用酶对底物的特殊亲和力修饰酶分子活性中心 的某一特定氨基酸残基的侧链基团。
亲和标记（位点专一性修饰）
亲和修饰剂： ①与底物结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲 和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力 小。 ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心 的基团形成稳定的共价键。
二、酶分子的化学修饰
1. 酶的表面化学修饰 （1）大分子结合修饰 （2）侧链基团修饰（小分子修饰） （3）交联法 （4）固定化修饰（共价结合法） 2. 酶分子内部修饰 （1）肽链有限水解修饰 （2）核苷酸链剪切修饰 （3）氨基酸置换修饰 （4）核苷酸置换修饰
（1）大分子结合修饰 P138 （macro molecules combine modification）
双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。 ▪ 修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法。
-NH2
糖肽（Glycopeptide）的修饰反应:
▪ 糖肽：人纤维蛋白或-球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，分 子上的游离氨基活化后可与酶分子上的氨基反应。
▪ 修饰方法：异氰酸法、戊二醛法。
聚乳糖修饰反应：
▪ 聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与 酶分子上氨基反应。
第一节 酶的活性中心（active center）
一、活性中心的概念 酶分子中的一小部分区域——
❖ 由酶分子中少数氨基酸残基参与组成 ❖ 与底物发生结合和催化作用 ❖ 与酶活力直接相关
二、酶活性中心的共性
1. 酶的活性中心是由必需基团(essential group)构 成的与酶催化活性有关的特定区域，其构象不 是固定不变的（诱导契合）。
CH2
丝氨酸
CH2 H2N CH C OH
COOH
OH O
CH2
天冬氨酸
CO
CH2 CO
谷氨酸
H2N CH C OH
SH
OH
O OH
CH2
半胱氨酸
O H2N CH C OH
NH 2
O SH
H2N CH C OH CH2
H2N CH C OH
N
CH2
CH2
酪氨酸
OHΒιβλιοθήκη CH2 N组氨酸CH2
N
H 赖氨酸 CH2
一、金属离子置换修饰 P136 （metal ion substitute modification）
将酶分子中的金属离子置换为另一种金属离 子，使其催化特性发生改变的修饰方法。 1. 方法： 酶的分离纯化 除去原有金属离子：加入金属螯合剂，去除 螯合物 加入置换离子
2. 作用： 阐明金属离子对酶催化作用的影响 提高酶的催化效率 增强酶的稳定性 改变酶的动力学特性