DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展

DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展

卞广兴　郭葆玉

第二军医大学药学院生化药学教研室(上海,200433)

摘要　双链断裂(doub le strand b reak s,D SB s)是细胞染色体复制过程中经常出现的DNA损伤,它的修复过程在真核生物中以同源重组(homo logy recom b inati on,HR)修复为主。正常机体中有着一系列的基因和蛋白及时修复这些损伤,这些蛋白归属于RAD52上位性集团(RAD52ep istasis group)。它们对细胞发挥功能和维持生存意义重大,近来国外研究十分活跃。

关键词　同源重组;双链断裂

1　与HR有关的基因和蛋白

在多种多样的生物体中,基因组保持完整具有极为重要的意义。它是细胞发挥功能和维持生存的必要条件。生物体基因组暴露于离子射线或者受内切酶作用,特别是在染色体自我复制过程中都会出现双链断裂。如果这些断裂未能及时修复就会引起细胞的染色体丢失或导致细胞的死亡。修复不正确也会引起基因的突变和染色体的重组。真核生物对这些断裂的修复有两种机理:非同源末端连接(non2 hom o logy end j o in ing,N H EJ)和同源重组(hom o l2 ogy recom b inati on,HR)。

同源重组是发生在DNA的同源序列之间的重组方式。真核生物非姊妹染色子体的交换,姊妹染色子体的交换,细菌及某些低等真核生物的转化,细菌的转导,接合,噬菌体的重组等都属于这一类型。有人认为,在原核生物中D SB s的修复以HR方式为主;而对于真核生物,其它的修复方式才是主要的。但近几年对酵母和哺乳动物细胞的研究发现,真核生物中的HR不仅在机理上与原核相似,而且具有同等的重要性[1]。

在HR中起重要作用的蛋白归属于R ec A家族,其中R ec A是其中的第一个成员,它是一个由R ec A基因编码的蛋白,在E.coli的HR和DNA复制中起重要作用。近几年来,研究发现了R ec A的很多同源蛋白,如T4噬菌体中的U vsX和哺乳动物细胞中的R ad51等。它们被统称为RAD52上位性集团。包括:RAD50、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59、M R E11和XR S2、XRCC2等。它们的突变缺失细胞都表现出对离子射线的敏感和有丝分裂 无丝分裂缺陷,表明它们是D SB s修复的某条途径的组成部分[2]。其中的不少成员就是在研究射线照射对生物体的作用(radiati on sen si2 tive m u tati on)中发现的,其命名也沿袭了原来的名称(RAD)。从酵母到脊椎动物基因序列的高度保守性表明它们在HR中有着类似的功能。研究中,符合这两者的因子大都可归于RAD52上位性集团。这其中最重要的是RAD51、RAD52和RAD54。

RAD51在所有的细胞中都表达,可能执行链交换的功能。它的作用同R ec A相似,但又不完全相同。Sonoda等[3]把人的RAD51转入鸡B细胞系的D T40细胞发现,RAD51缺失的细胞静息在细胞周期的G2 M期,累积对细胞有毒害作用的染色体断裂并最终死亡。同时发现大多数可探测到的染色体缺失是异染色质型的缺口或断裂,同一染色体的姊妹染色单体在同样的基因座断裂。这表明很多不可修复的裂隙是复制过程中产生的双链断裂的可能原因。尽管RAD51的分布远比其它因子广泛,研究表明它并不是D SB s诱导的所有重组修复形式中应用最广的因子[4]。RAD51在D SB s诱导的同源染色体交换中是必须的,但它对于其他形式的重组,如自发重组(spon taneou s recom b inati on),却并不是必须的。不过,RAD52在已知的这些重组形式中却都是必须的。

RAD52是重组中最重要的蛋白,它在真核细胞中进化保守,原核中基因序列差别较大。R ad52在体内形成多聚体的环,既可以连接DNA链末端又可促进互补链的退火。人的R ad52具有类似的特性。细胞在缺失RAD52的情况下几乎所有形式的HR 都被阻断了[4]。但是研究发现,剔除了RAD52的脊椎动物细胞可以存活而不会象剔除了RAD51等那样严重(死亡),有人认为这可能是细胞中还有其它起类似作用的因子未被发现[5]。

RAD55和RAD57同RAD51具有某些同源

性。这些蛋白可以帮助RAD51装到单链DNA上去,如同E.coli中的R ecF、R ec O和R ecR蛋白的作用一样,哺乳动物更有几个特有的RAD51的同源物RAD51B,RAD51C,XRCC2和XRCC3[6]。这些蛋白同RAD55和RAD57蛋白一样参与DNA损伤的修复,起着重要的作用。

RAD54基因是SN F2 S W I2的超家族成员之一。含有大多数DNA解旋酶含有的7个主要区域。无论在体内还是在体外试验中,RAD54蛋白同RAD51蛋白总是结合在一起的,提示它可能是一个蛋白复合物的组成部分。可能参与了重组过程中染色质的相互接近,但其具体作用有待进一步研究。其缺失在真核生物中表现为对放射性的敏感和同源替换的减少[7]。K lein等报道了啤酒酵母(saccha2 rom yces.cerevisiae)中发现的一个同源物。它不表现RAD54所具有的对化合物MM S的敏感性但可提高RAD54对MM S的敏感性。研究发现它只有在双倍体基因重组过程中是必要的,而且只对同源基因间交换起作用而不对染色体内基因的交换起作用[8]。

2　D SBs修复的可能机理

酵母中的基因研究表明R ad52参与了两条重组途径:①发生在DNA一致序列间的单链退火。②R ad51、R ad54、R ad55和R ad57参与的同源重组, R ad52在这其中起退火互补单链的作用;其中,在有丝分裂中出现D SB s时,R ad52帮助D SB s上重组复合物的形成,帮助R ad51的定位,从而启动同源链的交换[9]。R ad52同样与三聚体的单链结合复合物复制因子(R PA)相互作用。R ad51同其它几种重要的重组蛋白R ad54,R ad55,R ad56和R ad57相互作用完成R ad51介导的链交换[10]。这是一个线性双螺旋DNA链转到一个R ad51包被的单链环上的过程。各种体外试验均证明这些因子参与了这一过程,但是它们在体内究竟如何作用:作为一个整体的组成部分还是连续的作用还有待于进一步研究。

RAD52可以连接到D SB s上,保护它免受内切酶攻击并促进链的末端2末端相互作用。这些特性非常类似于Ku蛋白[11]的作用,据此有人提出D SB s 通过RAD52依赖性的同源重组和Ku蛋白依赖性的非同源末端连接修复的机理模型[12]。在N H EJ方式中R ad50 M re11 X rs2在Ku蛋白的作用下连接到D SB s处,由X rcc4 DNA连接酶 直接将断裂连接起来。其缺失片段无法修复。在HR中,R ad50

11 2在52的作用下连接到处,启动由RAD51介导的链交换,在RAD54、RAD55、RAD57的帮助下,同源DNA间进行链交换,修复可能的缺失并连接DNA链的断裂。

这个模型同样可以解释前面的问题,在高等生物中,Ku蛋白是大量存在的,所以R ad52- -的哺乳动物细胞都不会有严重的表形缺陷(死亡),而在低等的酵母中,Ku蛋白介导的非同源末端连接只占很少一部分,R ad52- -突变住住表现出对离子射线的高度敏感。虽然,脊椎动物在R ad52缺失时不会表现严重的重组 修复缺陷,但它对D SB s的修复的重要性是不可低估的。因为哺乳动物的基因组有着大量重复序列,内含子等非编码序列。非同源末端连接导致的基因缺失或插入有较大可能性导致功能丧失或突变。所以为了避免突变,当姊妹染色体存在时同源重组是更好的选择。这也得到了试验的证实。

D resser的研究发现非同源末端连接在Χ射线引起的D SB s修复的早期是重要的,而在姊妹染色单体相互作用的后期,同源重组更为重要[14]。R ad52剔除的小鼠表型正常可能是存在其它的功能通路代替了它的末端连接作用[15]。

在高等真核细胞中,自发的等位基因重组频率很低,只有10-8水平。所以通过体内基因打靶进行基因治疗在现阶段是不实际的,除非打靶效率将来会有着非常显著的提高。从这个模型可以看出, R ad52在哺乳动物细胞中的表达,可以促进同源打靶的频率,而且用线性DNA载体,下调Ku的表达同时提高R ad52的表达,可以使同源打靶的效率显著提高。这对基因治疗的开展有某种意义。

3　展望

近几年,关于D SB s体内修复的详细过程的研究论文不多。因为现有的研究方法有着很大的局限性,方法的匮乏给试验研究带来了困难。众所周知, D SB s的体内修复过程是不可逆的,对其中间环节及产物的研究就很困难。现有的研究方法有两种:一是对基因进行突变后研究细胞表型特征,以了解各种因子可能参与的反应途径;二是Seagall等[15]发展的翻转重复系统方法(inverted2rep eated systym)。它可以部分的恢复几种经典的重组产物。采用这一方法我们搞清了细菌的重组过程: R ec BCD途径及R ecE.F途径。但要搞清真核生物的重组过程我们还需建立能够进行完整的重组反应的体外的实验系统。并且很有可能参与这些反应的一些酶或其它的成分还有待于进一步的发现,才能使这一过程及理论更加完善和明白。虽然D SB s导