荧光免疫试验

3.标本片需保持湿润，避免干燥
4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本 上
荧光抗体染色及结果判断
-：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。 ++ ：荧光明亮。 +++：耀眼强荧光。 特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈或±。 根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
第三节 流式荧光免疫试验
与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
第二节 间接免疫荧光试验
一、基本原理 特异性抗体与相 应抗原反应，荧 光素标记的抗抗 体再与第一抗体 结合。
间接荧光抗体染色法示意图
间接免疫荧光法示意图
间接法：
优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原
既可用于检测抗原，也可检测抗体
缺点：易出现非特异性荧光
5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素
作用下，发射荧光减弱甚至消退称为
荧光淬灭。 如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯
胺、酚、硝基苯、I 等
。
荧光淬灭
如何避免： 勿长时间照射 脉冲瞬间照射 避光保存
猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质
（二）荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 四乙基罗丹明 (RB200)
时间分辨荧光免疫测定
5.信号增强
酸性增强液
结合β-二酮体
Eu3+标记 抗原抗体 复合物
Eu3+ 解离
荧光 增强
时间分辨荧光免疫测定
流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):
采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行 高通量分析的检测方法。 悬浮阵列；流式微球阵列
第四节
其他与荧光检测相关的免疫试验
时间分辨荧光免疫测定 其他荧光免疫试验 荧光偏振免疫测定 荧光酶免疫测定
教学目的
掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色 与结果判断。
熟悉：荧光物质。
了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的 基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫
技术的应用。
第一节 荧光免疫试验的组成因素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验
第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验
第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素
一、时间分辨荧光免疫测定
（一）基本原理
1.时间分辨
自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～
1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定 镧系元素特异荧光
时间分辨检测原理示意图
时间分辨荧光免疫测定
2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波 长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光 谱和发射光谱不重叠
时间分辨荧光免疫测定
3.发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏 度高
时间分辨荧光免疫测定
4.荧光标记物的相对比活性 比活性 ：单位时间内每个标记分子 可被探测到的信号量。
Eu3+螯合物 反复激发 1000次/秒 大大提高了荧光标记物比活性
3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率 ------荧光效率
激发光强度及激发光波长
决定于
发射荧光的光量子数（荧光强度）
荧光效率 ＝
吸收光的光量子数（激发光强度）
决定于
荧光色素本身的物理特性
4.荧光寿命
定义:荧光种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):
以荧光物质标记抗体和抗原，通过与 相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以
此对待测物进行定位、定性和定量分析的
检测技术，具有高度特异性、敏感性和直
观性，是最早出现的免疫标记技术。
第一节 荧光免疫试验的组成要素
荧光物质吸收激发光的能量后， 电子从基态跃迁到激发态，当其回 复至基态时，以发射光形式释放出 能量，称为荧光。
吸收能量 基态 激发态
荧光效率
荧光特点：
1 可产生荧光的分子或原子在接受 能量后即刻引起发光；
2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消 失；
一 荧光及荧光物质基础知识
(一)荧光的基本知识 1.发射光谱:指固定激发光波长，在不 同波长下记录到的标本发射荧光的谱图。
2.激发光谱:指固定检测发射光波长， 用不同波长的激发光照射标品得到的荧 光的谱图。
最大吸收 光谱 最大发射光谱 应用
490～ 495nm 570～ 575nm
520～530nm （黄绿色） 595～600nm （橙红色）
FAT、荧光偏振免 疫测定 FITC的衬比染色或 双标记FAT
藻红蛋白（PE）
7-氨基-4-甲基香豆素 Eu3+螯合物
490560nm
354nm 340nm
595nm （红色）
方法较麻烦
操作时间较长
应用：自身抗体的检测
二、实验方法
标本片上滴加特异性抗体 37℃30min PBS洗涤 滴加二抗 37℃30min PBS洗涤 镜检
三、注意事项
1.荧光染色时间：一小时内或2~8℃保存4小时，
2.三种对照：①阳对：阳性血清+荧光标记物
②阴对：阴性血清+荧光标记物
③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
430nm （蓝色） 613nm
双标记FAT、流式 细胞术
双标记或多标记 FAT 时间分辨荧光免疫 测定
二、荧光显微镜
荧光显微镜
利用一定波长的激发 光对待测标本进行激发， 产生一定波长的荧光， 对组织细胞结构或其组 分进行定性、定位和半 定量分析检测。
滤光片
荧光显微镜
隔热滤光片： 位于灯室聚光器前， 作用阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片： 位于光源和物镜之间， 作用能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片： 位于物镜和目镜之间， 作用阻断激发光而使发射的荧 光透过，保护眼睛。
光路
透射光：照明光线从标 本下经聚光器透过标本
荧光显微镜
进入物镜。
落射光：照明光线从标
本上经垂直照明器落射
到标本，经标本反射进
入物镜。
透射荧光显微镜光路 (a) 落射荧光显微镜光路 (b)
三、荧光素-抗体结合物
1、抗体要求
高特异性
高亲和力
经纯化提取IgG
2 荧光素要求
有能与蛋白质形成共价健的化学基团 荧光效率高， 荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。 标记方法简单、安全无毒。