葡萄糖氧化酶检测方法-backup

B I O F N O R N O O N
葡萄糖氧化酶检测方法
1.1 酶活力
1.1.1 原理
葡萄糖和氧反应，在葡萄糖氧化酶的作用下，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化氢酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。

1.1.2 试剂和溶液
特殊说明，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T 6682中规定的三级水。

1.1.
2.1 磷酸盐缓冲溶液，pH 为6.0。

称取二水磷酸二氢钠16.61g 和十二水磷酸氢二钠35.82g ，溶于无二氧化碳的水中，稀释至1000mL 。

1.1.
2.2 邻联茴香胺甲醇缓冲溶液。

称取邻联茴香胺1g 加入100ml 甲醇中搅拌溶解备用。

临用时现配，取0.1ml 加入到上述缓冲溶液12mL 中混匀。

1.1.
2.3 葡萄糖水溶液，浓度为180g/L 。

称取葡萄糖18g ，加水溶解，定容至100ml 。

1.1.
2.4 辣根过氧化物酶液,浓度为0.033%。

称取辣根过氧化物酶（HRP ，美国Ameresco 公司）10mg ，溶于30ml 蒸馏水。

1.1.3 仪器与设备
a) 分析天平：感量0.0001 g 。

b) pH 计：精确至0.01。

c) 磁力搅拌器：附加热功能。

d) 电磁振荡器。

e) 离心机：4000 r/min 。

f) 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。

g) 秒表：每小时误差不超过5s 。

h) 可见分光光度计：能检测350—800nm 的吸光度范围。

i) 移液器：精度为1uL 。

1.1.4 实验方法
1.1.4.1 反应用酶液的制备
固态产品用万分级天平称取样品1g （精确至0.0001g ），用磷酸盐缓冲溶液（2.7.2.1）定容至100mL 。

磁力搅拌30min ，上离心机6000r/min,离心5 min 。

取上清液，再用磷酸盐缓冲溶液（2.7.2.1）做适当稀释。

液态产品用移液枪吸取1.00mL ，用磷酸盐缓冲溶液（2.7.2.1）做适当稀释。

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注：稀释后的待测酶液测得的△A 值在0.15-0.65。

1.1.4.2 测定步骤
每个试样应取两份平行样进行分析测定，吸光度值差值不超过0.02视为有效平行值。

1.1.4.3 试样酶活力的计算
试样中葡萄糖氧化酶的酶活力以X 表示，单位为U/g 或U/mL ，按下式计算：
式中：
A 1——平行样酶液反应后吸光值的算术平均值； A 0——平行样酶液反应前吸光值的算术平均值；
N ——试样的稀释倍数；
11.3——消光系数；
t ——待测液与底物反应时间，单位为分钟（min ）；
0.1——试样的体积，单位为毫升（mL ）；
t ——待测液与底物反应时间，单位为分钟（min ）； m ——试样的质量，单位为克（g ）。

结果表示至整数。