葡萄糖氧化酶检测方法-backup
![葡萄糖氧化酶检测方法-backup](https://img.360docs.net/imgba/1ltgfs4a2pbidmy0klp2a6jqfeg6aprc-a1.webp)
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
B I O F N O R N O O N
葡萄糖氧化酶检测方法
1.1 酶活力
1.1.1 原理
葡萄糖和氧反应,在葡萄糖氧化酶的作用下,生成葡萄糖酸和过氧化氢,过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化氢酶的作用下,生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。 1.1.2 试剂和溶液
特殊说明,所用的试剂均为分析纯,水均符合GB/T 6682中规定的三级水。
1.1.
2.1 磷酸盐缓冲溶液,pH 为6.0。 称取二水磷酸二氢钠16.61g 和十二水磷酸氢二钠35.82g ,溶于无二氧化碳的水中,稀释至1000mL 。
1.1.
2.2 邻联茴香胺甲醇缓冲溶液。
称取邻联茴香胺1g 加入100ml 甲醇中搅拌溶解备用。临用时现配,取0.1ml 加入到上述缓冲溶液12mL 中混匀。
1.1.
2.3 葡萄糖水溶液,浓度为180g/L 。
称取葡萄糖18g ,加水溶解,定容至100ml 。
1.1.
2.4 辣根过氧化物酶液,浓度为0.033%。
称取辣根过氧化物酶(HRP ,美国Ameresco 公司)10mg ,溶于30ml 蒸馏水。
1.1.3 仪器与设备
a) 分析天平:感量0.0001 g 。 b) pH 计:精确至0.01。 c) 磁力搅拌器:附加热功能。 d) 电磁振荡器。 e) 离心机:4000 r/min 。 f) 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃。 g) 秒表:每小时误差不超过5s 。
h) 可见分光光度计:能检测350—800nm 的吸光度范围。
i) 移液器:精度为1uL 。
1.1.4 实验方法
1.1.4.1 反应用酶液的制备
固态产品用万分级天平称取样品1g (精确至0.0001g ),用磷酸盐缓冲溶液(2.7.2.1)定容至100mL 。磁力搅拌30min ,上离心机6000r/min,离心5 min 。取上清液,再用磷酸盐缓冲溶液(2.7.2.1)做适当稀释。
液态产品用移液枪吸取1.00mL ,用磷酸盐缓冲溶液(2.7.2.1)做适当稀释。
B I O F N O R N O
注:稀释后的待测酶液测得的△A 值在0.15-0.65。
1.1.4.2 测定步骤
每个试样应取两份平行样进行分析测定,吸光度值差值不超过0.02视为有效平行值。
1.1.4.3 试样酶活力的计算
试样中葡萄糖氧化酶的酶活力以X 表示,单位为U/g 或U/mL ,按下式计算:
式中:
A 1——平行样酶液反应后吸光值的算术平均值; A 0——平行样酶液反应前吸光值的算术平均值;
N ——试样的稀释倍数;
11.3——消光系数;
t ——待测液与底物反应时间,单位为分钟(min );
0.1——试样的体积,单位为毫升(mL );
t ——待测液与底物反应时间,单位为分钟(min ); m ——试样的质量,单位为克(g )。 结果表示至整数。