微生物生化反应

溴甲酚紫指示剂
+ 糖氧化发酵(O-F)试验：该试验是由Hugh和Leifson创立，
+
+
+
+
故又称Hugh-Leifson(HL)试验。 原理：细菌对糖的代谢，分为氧化和发酵2种类型，不分 解葡萄糖的细菌，称为产碱型。利用此试验可区别细菌的 代谢类型。 方法：取2支HL培养基。指示剂为溴麝香草酚蓝 ，煮沸10 分钟以驱逐培养基中的氧气。冷却后将被检细菌接种到2 支培养基中，其中一支加灭菌的液体石蜡或凡士林厚约 lcm，置于35℃培养3～4天，观察结果。 结果：2管均不产酸(不变色)为阴性；2管均产酸(变黄)为 发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧 化型。 应用：绿脓杆菌为O型，产碱杆菌为产碱型
+ 原理：各种细菌含有不同的分解糖(苷、醇)的酶，对糖 + +
(苷、醇)分解能力也各不相同，可用来鉴别细菌。 方法：将待检细菌接种葡萄糖、乳糖或其他发酵管，35℃ 培养18～24h观察结果。 结果：首先确定细菌是否生长，细菌生长者培养基呈混浊 状，再确定细菌对糖类分解情况 不分解糖，培养基颜色与接种前相比无变化，记录时以 “-”表示； 分解糖产酸不产气，培养基中的指示剂变色，记录时以 “+”表示； 分解糖产酸产气，除培养基中的指示剂变化外，液体培养 基的倒管中还有气泡；若为半固体培养基，则培养基内出 现气泡或琼脂断裂，记录时以“⊕”表示。
+ 杆菌肽试验：A群链球菌
+ Optochin敏感试验：肺炎球菌 + O/129抑菌试验：弧菌、邻单胞菌
+ 原理：该培养基用酚红作指示剂，在酸性时呈黄色，
碱性时呈红色。细菌如能发酵乳糖和葡萄糖而产酸 产气，则斜面与底层均呈黄色，且有气泡。如只发 酵葡萄糖不发酵乳糖，因葡萄糖含量较少(占乳糖量 的十分之一)，斜面所生成的少量酸可因接触空气而 氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层 由于是在相对缺氧状态下，细菌发酵葡萄糖所生成 的酸类物质不被氧化挥发而仍保持黄色。如细菌分 解蛋白质产生硫化氢，则与硫化亚铁作用生成黑色 的硫化铁，使培养基变黑。
肠杆菌科细菌均能还原 硝酸盐为亚硝酸盐。
有些细菌能使硝酸盐或 亚硝酸盐还原为氮，如 假单胞菌等，硝酸盐或 亚硝酸盐还原生成气体 氮或氧化氮，称为脱硝 化或脱氮化作用。
+ 原理：致病性葡萄球菌产生血浆凝
+ +
+
+
固酶可使血浆凝固。 方法： 玻片法：玻片上滴加生理盐水后挑 菌混匀，无自凝现象发生则挑取 2～3环人（兔）血浆混合，10s内 出现凝集为阳性，同时应设阴性对 照。 试管法：用稀释1：4的人（兔）血 浆0.5ml与一大环待检菌混合， 35℃1～4h后出现凝块为阳性，同 时应设阳性与阴性对照 应用：鉴定致病性葡萄球菌
吲哚试验 （I)
甲基红试验 (M）
VP试验 （V）
枸橼酸盐利用试验 （C）
+ 原理：某些细菌(如脑膜炎奈瑟菌、铜
+
+ + +
绿假单胞菌等)具有氧化酶，能将盐酸 二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二 胺氧化成紫红色的醌类化合物。 方法：用滤纸条沾取被检菌落，用毛 细管吸取氧化酶试剂，滴加于滤纸条 菌落上(或直接将试剂滴加于培养皿菌 落上)。 结果：阳性者立刻出现红色，继而逐 渐加深(如加的试剂是盐酸四甲基对苯 二胺，阳性呈蓝色)。阴性不变色。 应用：脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌 为阳性，肠杆菌科细菌为阴性。 纸片法：取菌落涂在氧化酶试纸上， 10s内成深紫色为阳性，1min后仍不变 色为阴性。
+ 原理：B群链球菌能产生CAMP因子，增强金黄色葡
萄球菌的溶血能力，在两菌交界处出现箭头样溶 血区。 + 方法：先用产溶血素的金黄色葡萄球菌在血平板 上划一横线，再取待检链球菌作一垂直划线接种， 两者相距0.5～1cm， 35℃培养18～24h观察结果。 用B群链球菌作阳性对照，A群或D群作阴性对照。 + 结果：在两种细菌划线交界处，出现箭头形透明 溶血区为阳性。
+ 原理：胆盐、去胆盐酸钠和牛黄胆酸
+ +
+
+
能选择性溶解肺炎链球菌而对其他链 球菌无作用。 方法： 平板法：取一接种环100g/L去氧胆酸 钠放在待检菌落上，35℃30min观察 结果，菌落被溶解消失为阳性。 试管法：取0.9ml 18～24h液体培养 物内加入100g/L去氧胆酸钠0.1ml， 混匀，37℃水浴10～30min，培养液 清凉者为阳性。同时设生理盐水对照。 应用：肺炎链球菌阳性，甲型链球菌 阴性。
+ 方法：将待检菌接种于克氏双糖铁培
+
+
+ 原理：当细菌可以利用铵盐作为惟一的
氮源，同时利用柠檬酸盐作为惟一碳源 时，可在柠檬酸盐培养基上生长，并分 解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱， 指示剂变色。若细菌不能利用柠檬酸盐 为碳源，则细菌不能生长，培养基不变 色。 + 方法：将待检菌接种于柠檬酸盐培养基 中，35℃培养24～48h观察结果。 + 结果：若有菌苔出现，培养基变为深蓝 色为阳性。细菌不能生长，培养基不变 色，为柠檬酸盐利用试验阴性。 + 应用：产气肠杆菌为阳性，大肠埃希菌 为阴性。
+ 原理：有些细菌具有过氧化氢酶，能分解过氧化氢，释放
出初生态氧，生成氧分子而出现气泡。 + 方法：分别挑取固体培养基上的待检菌落，置于洁净玻片 上，滴加3％过氧化氢溶液数滴，观察结果。 + 结果：于半分钟内有气泡产生者为阳性，不产生气泡者为 阴性。 + 应用：常用金黄色葡萄球菌作阳性对照，链球菌作阴性对 照。
产碱型
发酵型 溴麝香草酚蓝指示剂
氧化型
+ 原理：细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一
种是半乳糖苷渗透酶，另一种为β -半乳糖 苷酶。ONPG可迅速进入细菌细胞，被半乳糖 苷酶水解，释出黄色的ONP，故由培养基液 变黄可迅速测知β -半乳糖苷酶的存在。 + 方法：取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养 基上置37℃培养1～3h或24h + 结果：如有β -半乳糖苷酶，会在3h内产生 黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不 变色。 + 应用：大肠杆菌阳性，伤寒杆菌阴性
酚红指示剂
+ 原理：某些细菌(如变形杆菌属)，可产生苯
+ + + +
丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮 酸，加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后形 成绿色化合物。 方法：将待检菌接种于苯丙氨酸琼脂斜面上， 于35℃培养18～24h。 结果：在斜面培养物上滴加10％三氯化铁溶 液观察结果，出现绿色为阳性。 应用：变形杆菌为阳性，大肠埃希菌为阴性。 快速纸片法：取待检菌涂于苯丙氨酸脱氨酶 试纸上，35℃ 15min后滴加10％三氯化铁溶 液，观察。绿色为阳性，无色为阴性。
+ 原理：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，
进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性 环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨 中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红 色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养 基中胍基含量少，加入少量含胍基的化 合物如肌酸肌酐，以加速其反应。 + 方法：将待检接种于葡萄糖蛋白胨水中， 37℃培养24～48h，于培养物中加入VP试 剂（a-萘酚无水乙醇溶液和含肌酸或肌 酐的氢氧化钾溶液）各1滴，充分摇动试 管，观察结果。 + 结果：如立即或于数分钟内出现红色反 应者为阳性；若为阴性应将试管置37℃ 中4h后再进行观察，仍无红色者为阴性。 + 应用：大肠埃希菌阴性，产气肠杆菌阳 性。
+ 原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐、氨和氮等。
一般硝酸盐还原试验，系测定还原过程中所生成的亚硝酸盐。如培养 基中有亚硝酸盐存在，与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺 酸作用，成为重氮苯磺酸，后者与a-萘胺结合为红色的N-a-萘胺偶氮 苯磺酸。 + 方法：将待检菌分别接种硝酸盐培养基，35℃培养1～4天，每天吸取 培养液0.5～1ml，加入硝酸盐还原试剂(甲、乙液等量混合)O.1ml观 察结果。 + 结果：阳性者立刻或于10min内呈红色，阴性者不变色。如欲检查有 无氮气产生，可于培养基内加一只小倒管，管内有气泡产生，表示有 氮气生成。如加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否被还原， 可于原试管内再加少许锌粉，如出现红色，表示硝酸盐仍然存在。若 不出现红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮。 + 应用：肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐，铜绿假单胞菌能产 生氮气，醋酸钙不动杆菌为阴性。
+ 原理：某些细菌具有七叶苷酶，水解七叶
苷后产生七叶素与亚铁离子反应形成黑色 酚铁络合物，使培养基变黑。 + 方法：将被检菌接种于七叶苷培养基， 37℃培养18～24h + 结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性 + 应用：D群链球菌为阳性，其他链球菌为阴 性
+ 原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮
酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙 酸等酸性物质，故培养基pH在4.5以 下，加入甲基红指示剂后呈红色(阳 性)。有些细菌分解葡萄糖产生的酸进 一步转化为醇、酮等非酸性物质，使 培养基pH在6.2以上，加入甲基红试 剂呈黄色(阴性)。 + 方法：将待检菌接种葡萄糖蛋白胨水 培养基中， 37℃培养18～24h + 结果：在培养物中加入甲基红指示剂 2～3滴，立即观察，红色为阳性，黄 色为阴性。 + 应用：大肠埃希菌阳性，产气肠杆菌 阴性。
+ 原理:某些细菌能产生色氨酸酶，
可分解蛋白胨中的色氨酸而生 成靛基质(吲哚)，后者与对二 甲氨基苯甲醛作用，形成红色 的玫瑰靛基质(玫瑰吲哚)。 + 方法:将待检菌接种于蛋白胨水 培养基中，经35℃培养24～48 小时，取出后加上述试剂数滴， 观察两层液面的颜色。 + 结果:出现红色液面为阳性，黄 色液面为阴性。 + 应用:大肠杆菌为阳性，产气肠 杆菌为阴性。
+ + + +
原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，分解氨基酸，使其脱掉羧基，生成胺和 CO2，称脱羧反应；并使培养基变碱，可用指示剂显示出来。 最常用的氨基酸有三种，L-赖氨酸脱羧形成尸胺，L-鸟氨酸脱羧形成腐胺， L-精氨酸脱羧形成精胺。 方法：将待检菌接种氨基酸脱羧酶培养基和对照培养基，并加入无菌液体 石蜡，于35℃培养1～4天，每天观察结果。 结果：对照管在培养18～24h后，应保持黄色。氨基酸测定管由黄变紫(溴 甲酚紫为指示剂)或由绿变蓝(溴麝香草酚蓝为指示剂)为阳性，黄色为阴性。 如对照管为阳性(紫色或蓝色)，则所有氨基酸脱羧酶试验皆无效，不能作 出判定。 应用：乙型副伤寒沙门菌为阳性，普通变形杆菌为阴性。 沙门菌属中除伤寒沙门菌和鸡沙门菌外，为鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶试验均 阳性；志贺菌属中除宋内志贺菌外，为鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶试验均为阴 性。除奇异变形杆菌为鸟氨酸阳性外，其余变形杆菌鸟氨酸和赖氨酸脱羧 酶试验均阴性。
+ 鉴定细菌的生化反应主要有哪些类别
+ 常用的生化试验操作方法与结果判断
+ 不同细菌产生的酶不同，对底物的分解能力不同，代谢产 +
wenku.baidu.com
+
物不同。 微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物， 生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微 生物。 种类 碳水化合物代谢试验 蛋白质、氨基酸代谢试验 碳源利用试验 酶类试验 其他试验
+ 原理：产生DNA酶的细菌能水
解DNA成寡核苷酸链，DNA长 链可被酸沉淀，寡核苷酸链 则能溶于酸 + 方法：将待检菌接种于DNA琼 脂平板， 35℃培养18～24h， 用1mol/L HCl浸没菌落，观 察结果。 + 结果：菌落周围出现透明环 为阳性，否则为阴性 + 应用：常用于金黄色葡萄球 菌、沙雷菌和变形杆菌鉴定， 为阳性。
+ 原理：有些细菌分解含硫氨基酸产生硫化
氢，遇到培养基中铅离子和二价铁离子会 产生黑色沉淀 + 方法：将待检菌接种于含铅或含亚铁离子 培养基中，经35℃培养18～24h小时 + 结果：有黑色沉淀产生为阳性 + 应用：大肠杆菌阴性，变形杆菌阳性
+ 原理：能产生尿素酶的细菌，
能水解尿素生成氨和CO2， 氨及其化合物使培养基呈碱 性。 + 方法：将待检菌接种于尿素 培养基中，置于35℃培养 2～4小时或过夜，取出观察。 如阴性者继续培养4天再观 察。 + 结果：培养基呈红色反应为 阳性；不变色或呈黄色为阴 性。 + 应用：大肠杆菌阴性，变形 杆菌阳性