免疫组化技术简介
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不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
结果判读
技术要点
取材
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（1×1×0.5cm）；取病变组织与正 常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 (经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载 玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细 胞有重叠） 各种体液、穿刺液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹 水等）。 培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。
没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的！
结果判读
抗原表达必须在特定部位 阳性标记细胞学特征可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质(浆)型；④ 微绒毛型；⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞 质兼有）等五种阳性细胞类型。 这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原 弥散假象，尤其是复合型图像。
注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的30 倍为宜；③必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或 膨胀的试剂；④固定时间一般以24小时为宜。
固定液的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学 反应选择适当的固定剂。如甲醇、丙酮、甲醛、乙醇等。
甲醛固定后，抗原容易被掩盖，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。
抗体。
多克隆抗体
➢ 由不同细胞产生，其免疫化学特性不同，能够识别抗原表面多种抗原
决定簇的多种抗体的混合物。
基因工程抗体
➢ 在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，甚至是在人工全合成
后导入受体细胞表达产生的新型抗体。
06
04
02
07
质
失 败 原 因
05
结
技 术 要 点
03
操
基 本 原 理
01
基
量
果
作
本
控
判
流
概
制
读
程
念
CONTENTS
目 录
基本原理
间接法 PAP法 直接法 LSAB法
显色 抗体 抗原
基本原理
显色系统 酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物
辣根过氧化物酶/HRP：DAB、AEC 碱性磷酸酶/AP ：AP-Red、NBT/BCIP
酶的选择
HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片：首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记，对比清晰
技术要点
石蜡切片 优点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和 细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。 缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。 冰冻切片 优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的 保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。 缺点：不易保存（-80℃）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成 抗原的弥散使定位不准确。
能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片！
技术要点
抗原修复
免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原 决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。 使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。
抗原修复常用方法：①酶修复法（胰蛋白酶、胃蛋白酶和无花果酶）； ②热修复（高压修复、微波炉修复、煮沸法）
✓ 取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。 ✓ 组织切块厚度不易超过0.5cm，以便固定液的及时渗透及脱水。
技术要点
固定
目的：①凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶；固定细胞 形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除 细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。
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失 败
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技 术
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基 本
01
原
要
原
因
点
理
质
结
操
基
量
ห้องสมุดไป่ตู้
果
作
本
控 制
判 读
流 程
概 念
CONTENTS
目 录
操作流程
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CONTENTS
目 录
技术要点
免疫原理的选择 一抗（属种、单/多抗、浓缩/即用型） 二抗（属种、标记方法） 显色方式
基本概念
抗原（Antigen, Ag）
➢ 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细
胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物 质。
抗体（Antibody, Ab）
➢ 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与
相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。
技术要点
抗体的保存 分装密封保存，避免对抗体的污染 并注明标记（批号、名称、效价、量） 根据厂家提供的保存条件保存 避免反复冻融而使抗体效价降低
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技 术
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流 程
概 念
CONTENTS
目 录
结果判读
必须设立对照 阳性组织对照 阴性组织对照 阴性试剂对照（空白对照；替代对照；吸收试验；抑制试验） 自身对照
基本概念
抗体的结构
二抗：羊抗鼠
一抗：鼠抗人
V区氨基酸的种类和排列顺 序千变万化，故可形成许多 种具有不同结合抗原特异性 的抗体。（抗原特异性，第 一抗体）
C区氨基酸的组成和排列在 同一种属动物Ig同型L链和同 一类H链中都比较恒定。
制备第二抗体的重要基础。
基本概念
单克隆抗体
➢ 由同一克隆细胞产生，针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性
体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白 质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry, IHC) 或 免 疫 细 胞 化 学 技 术 (immunocytochemistry, ICC)。
免疫组化技术简介
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概 念
CONTENTS
目 录
基本概念
免疫组化 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗
结果判读
技术要点
取材
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（1×1×0.5cm）；取病变组织与正 常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 (经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载 玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细 胞有重叠） 各种体液、穿刺液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹 水等）。 培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。
没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的！
结果判读
抗原表达必须在特定部位 阳性标记细胞学特征可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质(浆)型；④ 微绒毛型；⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞 质兼有）等五种阳性细胞类型。 这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原 弥散假象，尤其是复合型图像。
注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的30 倍为宜；③必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或 膨胀的试剂；④固定时间一般以24小时为宜。
固定液的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学 反应选择适当的固定剂。如甲醇、丙酮、甲醛、乙醇等。
甲醛固定后，抗原容易被掩盖，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。
抗体。
多克隆抗体
➢ 由不同细胞产生，其免疫化学特性不同，能够识别抗原表面多种抗原
决定簇的多种抗体的混合物。
基因工程抗体
➢ 在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，甚至是在人工全合成
后导入受体细胞表达产生的新型抗体。
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基 本 原 理
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目 录
基本原理
间接法 PAP法 直接法 LSAB法
显色 抗体 抗原
基本原理
显色系统 酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物
辣根过氧化物酶/HRP：DAB、AEC 碱性磷酸酶/AP ：AP-Red、NBT/BCIP
酶的选择
HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片：首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记，对比清晰
技术要点
石蜡切片 优点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和 细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。 缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。 冰冻切片 优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的 保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。 缺点：不易保存（-80℃）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成 抗原的弥散使定位不准确。
能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片！
技术要点
抗原修复
免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原 决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。 使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。
抗原修复常用方法：①酶修复法（胰蛋白酶、胃蛋白酶和无花果酶）； ②热修复（高压修复、微波炉修复、煮沸法）
✓ 取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。 ✓ 组织切块厚度不易超过0.5cm，以便固定液的及时渗透及脱水。
技术要点
固定
目的：①凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶；固定细胞 形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除 细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。
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技术要点
免疫原理的选择 一抗（属种、单/多抗、浓缩/即用型） 二抗（属种、标记方法） 显色方式
基本概念
抗原（Antigen, Ag）
➢ 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细
胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物 质。
抗体（Antibody, Ab）
➢ 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与
相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。
技术要点
抗体的保存 分装密封保存，避免对抗体的污染 并注明标记（批号、名称、效价、量） 根据厂家提供的保存条件保存 避免反复冻融而使抗体效价降低
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目 录
结果判读
必须设立对照 阳性组织对照 阴性组织对照 阴性试剂对照（空白对照；替代对照；吸收试验；抑制试验） 自身对照
基本概念
抗体的结构
二抗：羊抗鼠
一抗：鼠抗人
V区氨基酸的种类和排列顺 序千变万化，故可形成许多 种具有不同结合抗原特异性 的抗体。（抗原特异性，第 一抗体）
C区氨基酸的组成和排列在 同一种属动物Ig同型L链和同 一类H链中都比较恒定。
制备第二抗体的重要基础。
基本概念
单克隆抗体
➢ 由同一克隆细胞产生，针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性
体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白 质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry, IHC) 或 免 疫 细 胞 化 学 技 术 (immunocytochemistry, ICC)。
免疫组化技术简介
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基本概念
免疫组化 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗