毛细管电泳技术和应用新进展

文章编号:100421656(2001)0120004206
毛细管电泳技术和应用新进展
毛　煜,徐建明
(第二军医大学基础医学部化学教研室,上海　200433)
摘要:毛细管电泳(CE)是当前分析化学前沿领域和研究重点之一。

本文对毛细管电泳技术—分离模式、进样技术和检测器为线索对最近的研究进展进行了综述,探讨了各种模式和技术的分析效率。

并介绍了CE很有实用价值的几个方面的应用,包括在基因工程和单细胞分析中的突出表现,在手性分离和小分子离子分析方面的广泛应用。

关键词:毛细管电泳技术;基因工程;单细胞分析;手性分离;离子分析
中图分类号:O5819 文献标识码:A α
1　前言
毛细管电泳作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术,近年来发展迅猛并得到广泛应用。

由于CE显示了对生物分子如神经递质、肽、蛋白、核苷酸的分离分析和DNA 快速测序等的巨大潜力,符合以生物工程为代表的生命科学对各种对象的分离分析和微量制备的需求,所以它正逐步成为一种常用分析手段。

与经典电泳相比,CE克服了由于焦耳热引起的谱带展宽,柱效较低的缺点,确保引入高的电场强度,改善分离质量。

柱效高的可达每米几百万乃至几千万理论板数以上。

CE与高效液相色谱(H PL C)一样同是液相分离技术,很大程度上CE 与H PL C互为补充,但无论从效率、速度、用量和成本来说,CE都显示了它的优势。

CE没有泵输运系统,成本相对要低,且可通过改变操作模式和缓冲液成分,根据不同的分子性质(如大小、电荷数、手征性、疏水性等)对极广泛的物质进行有效分离,相比之下,为达到相同目的,H PL C要用价格昂贵的柱子和溶剂。

另外,CE在进样和检测时均没有象H PL C那样的死体积,且CE以电渗流为推动力,使溶质带在毛细管中原则上不会扩散,而H PL C以压力驱动,柱中流呈抛物线型导致谱带变宽,柱效降低。

概括起来CE有高灵敏度、高分辨率、高速度、低成本、低耗样、应用范围广等优点。

下面拟就毛细管电泳的技术和应用展望作一简要概括。

2　毛细管电泳技术研究
毛细管电泳作为一种技术在不断扩大应用范围,同时也着重注意自身的完善和发展。

一般地说,这种完善和发展主要涉及毛细管电泳的分离模式、进样技术和检测器。

211　毛细管电泳的分离模式
毛细管区带电泳(CZE)的分离机理是基于各被分离物质的荷质比的差异。

这是CE最基本的工作方式。

但其只能分析荷电粒子如氨基酸、蛋白、肽等。

1984年T erabe等提出的胶束电动毛细管色谱(M EKC),不仅能测离子,而且能测中性分子、手性对映体等。

毛细管凝胶电泳(CGE)由Karger 等于1987年提出。

由于凝胶具有粘度大、抗对流的特点,能减少溶质的扩散,所得峰型尖锐,柱效极高,是毛细管电泳的理想介质,但制备困难,寿命偏短,使用时易产生空泡。

后发展起来的无胶筛分,用粘度低的线性聚合物溶液代替高粘度的聚丙烯酰胺,同样起到使不同体积的溶质分子在充当“分子筛”的介质中电泳分离的目的,每次分离均用新胶,可避免空泡的产生,且比凝胶柱便宜、简单、寿命长,但分离能力稍差。

CGE现已广泛用于DNA片段的分离。

第13卷第1期2001年2月 化学研究与应用
Chem ical R esearch and A pp licati on
V o l.13,N o.1
Feb.,2001
α收稿日期:2000201205;修回日期:2000204210
毛细管等电聚焦(C IEF)用两性电解质在毛细管内建立pH梯度,使各种不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置,形成一非常窄的聚焦区带。

可用于测定蛋白质的等电点,分离异构体和其他方法难以分离的蛋白质。

毛细管等速电泳(C IT P)是一种较早的分离模式,可用较大内径的毛细管,在微制备中很有用处,可作为柱前浓缩方法用于富集样品。

毛细管电色谱(CEC)[1]是将H PL C发展起来的众多固定相填充到毛细管中或涂敷在毛细管壁上,使之如同色谱固定相一样参与分离。

可以说CEC是CE与H PL C的有机结合,既有CE的高柱效,又有H PL C的高选择性,利用涂层还可有效减少生物大分子如蛋白分子在毛细管壁的吸附,改善峰形,提高选择性,是一种很有发展前景的模式。

此外,还有在这些CE基本分离模式基础上利用各种技术建立起来的特殊的分离模式,如亲和毛细管电泳[2](利用生物分子或其他受体分子与其相应的专一分子可逆亲和特性来进行电泳分离),毛细管矩阵电泳[3](大量毛细管平行分离),微毛细管电泳[4](将微系统技术应用于CE,把化学反应的产物引入毛细管进行电泳分离。

微反应器各有不同,可通过在玻璃板上蚀刻形成的网来实现,进行一系列毛细管的平行操作。

也可将反应器通过针式阀与毛细管相连,在70℃下进样对DNA测序[5]。

微毛细管电泳装置柱短、场强大,因此速度快、效率高、检测限低,在当今纳米技术快速发展的情况下会显示出更大的发展前景)等等。

212　毛细管电泳的进样技术
CE分离效率高,但受到诸多因素的影响,进样是很重要的因素之一,同时,进样还影响初始样品区带的宽度和分析的重现性。

CE常用的定量进样技术有:电迁移进样、压差进样、进样阀进样、电分流进样、扩散进样等。

下面介绍几种较新的进样技术。

21211　直接在线进样[6]
传统的电迁移进样要把毛细管入口端从缓冲池移到样品池而不适于封闭体系,且进样有歧视现象。

Evan s设计的在线进样毛细管电泳很好地解决了这个问题。

在线进样由取样毛细管和分离毛细管在一个微交叉的组件中通过高压转换来实现。

样品在取样毛细管电渗流的作用下进入取样毛细管,通过进样毛细管中电流的大小来控制进样量。

在线进样排除了外界干扰,可用于封闭体系,且为联用分析提供了广泛前景。

21212　微进样装置
CE是在纳升级别上进行研究的技术,随着进样体积越来越小,就需要用微进样器,尤其在生命活体中对生物微小环境和单细胞进行的分析,操作和样品的引入是很困难的。

这些样品不仅体积小,而且在液体中迅速无规则地运动。

W LL I N GFORD制成最早的双管微进样器,在右管中放置一根10Λm的碳纤维电极作为高压端电极,利用电渗流使样品进入左管和毛细管。

但可靠性较差。

单管微进样器进行了改进,高压电极与进样管留有一定空间,因此不存在电耦合和电解干扰问题。

尖端极细(<10Λm),可刺入活体细胞中取样[7]。

Zare等用激光捕获的方法,把极少量的样品甚至单个细胞引入锥形毛细管[8]。

在进样时,为了控制流动和吸入过程,把一个精密注射器与毛细管相连,注射器的柱塞被一个测微计代替,调节测微器可控制极小的样品体积进样。

这种毛细管可根据需要拉伸成各种尺寸而不受毛细管内径的限制。

还有报道用2Λm内径的毛细管作为微进样器刺入单个细胞内,启动高压用电迁移进样方式吸取细胞质进行分析[10]。

Ew ing等用电迁移方式将蜗牛的单个神经细胞吸入毛细管进行分析,测得内含大约14FM OL的多巴胺,最小进样体积为270fL。

还用实验确证了多巴胺从细胞内释放的机理[9]。

微进样器在制作时应注意的问题是毛细管与这个微量进样装置要精密连接,使死体积尽可能小,提高重现性。

21213　近端进样及双向进样
A ltria等利用负压力和操作电压实现了由距检测器较近的一端进样,从而改善了毛细管电泳的性能[11]。

近端进样减少了分析时间,提高了灵敏度。

使用电压较低而允许使用较高浓度的电解质,提高了分辨率,减少了峰的拖尾现象。

Karl2 berg等运用了简单巧妙的双向进样方法先后从毛细管两端进样,解决了在一次运行中以单一检测器同时检测阳离子和阴离子的问题,并研究了两次进样时间间隔的变化对分离效率的影响[12]。

21214　CE与其他分析技术联用时的进样问题2121411　流动注射与毛细管电泳联用(F I—CE)利用流动注射快速、密闭、自动化等特点,
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　第1期 毛煜等:毛细管电泳技术和应用新进展
Karlber等设计了流动注射与毛细管电泳的连接[13]。

进样时,在恒高压的作用下,注入F I的样品在电解质的作用下流向接口,一小部分样品进入毛细管得到分离。

用这种接口可以在一次不间断的电泳分离中多次连续进样。

方肇伦等设计了带有锥形入口的流通池作为流动注射与毛细管电泳入口的接口[14]。

用来传输样品的溶液也用作毛细管电泳分离的缓冲液,通过进样器回转阀控制,由电迁移实现样品的分流进样。

这种装置样品的引入是在不断流动的非均相溶液中进行的,可连续进样。

与传统的手动进样相比提高了精确度。

2121412　液相色谱与毛细管电泳联用[15,16]在L C—CE联用中,样品从液相色谱流向毛细管电泳,两者的对接中毛细管的放置很重要。

因此,Jo rgen等人选择透明材料如热塑聚碳酸脂代替原来的钢材料[17],由它制作的接口部件通过溶液着色可直接观察到液体流动和进样过程。

进样时,电压降到0V,通过转换气动阀来停止横流、电动进样。

然后撤除进样电压,而横流继续送样品到废液口,通入一阵缓冲液,把多余样品清除后再加分离电压,避免了峰的拖尾。

以上介绍的几种进样技术。

从机理上说,这些方法依然是电迁移、电分流或压差进样,但对传统操作作了改进,在多种分析方法联用中妥善处理接口和样品引入的问题,提高了柱效。

213　毛细管电泳的检测器
由于CE中溶质区带超小体积的特性,对检测器灵敏度要求很高,可以说检测是CE中的关键问题。

现有的检测器可分为光学检测器、电化学、质谱、核磁共振检测器等。

CE中应用最广泛的是紫外 可见检测器(UV),其灵敏度较低,但通用性好,适用于小分子如药物类分析。

激光诱导荧光检测器(L IF)灵敏度可比UV高1000倍,但造价昂贵,大多数样品需要衍生。

当然这也增加了选择性。

DNA序列的分析必须用L IF,特殊的L IF可做到单分子水平检测。

已达到光谱分析方法的极限。

现已有大量相对廉价的激光光源可供选用,解决了L IF中激发波长较少及价格问题。

电化学检测器(ECD)中的安培检测器是CE 中最灵敏的检测器,可用于单细胞分析。

它可分为离柱安培检测和柱后安培检测。

前者首先由Ew2
[18],30的高压,在毛细管中的电流比电化学电流大6个数量级以上,为防止电流信号被电泳信号覆盖,必须将毛细管分离系统和检测系统进行电隔离,用接口联结。

由于接口不规则或有间隙,不可避免造成区带变宽。

H uang等[19]设计了柱后安培检测装置,B aldw in[20]用直径大于100Λm园盘电极进行射壁式安培检测,将工作电极正对着毛细管出口端,这时电干扰很小,无需用接口将分离部分与检测部分分开,这种无接口设计大大简化了装置,且对电极直径并不苛求,拓宽了电极材料的选择。

当然,工作电极相对位置对分离效率和灵敏度有很大影响。

将现今分离能力最强的CE和能提供组分结构信息的M S联用,是令人兴奋的技术。

CE M S 联用在肽链测序及蛋白结构、分子量测定、单细胞分析等方面有卓越表现[21]。

迄今为止,除了I CP和I R未作为CE的检测器外,其他检测方法均已和CE联用,但已商品化的只有UV,L IF和M S。

3　应用研究进展
毛细管的小孔径、高电阻、抗对流、大比表面积等特性使毛细管电泳(CE)可在高电场、小电流下工作,实现高效、快速的分析。

如今,CE已象GC和H PL C一样,通过多种模式在分析的各个领域成为重要分析手段。

本文只介绍其中几个方面的进展。

311　在基因工程研究方面的应用
毛细管电泳是以生命科学为依托发展起来的一项新技术。

CE用于DNA分析始于1988年,包括碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、引物、探针、单链DNA、双链DNA(DNA片断、PCR产物)分析。

通常用CGE或M EKC来进行基因的分离分析。

广泛用于基因突变、法医检验、遗传、临床诊断、DNA测序[22]等研究。

CE与传统的平板凝胶电泳相比省时、省力且自动化。

而高灵敏的安培检测器、L IF检测器的使用,极大地拓展了这方面的应用。

如L IF用于DNA分析可达z m o l范围。

前已述及,复杂的L IF 检测器可测定染色的DNA单个分子[23]。

对现在规模浩大的人类基因组计划而言,关键在于提高测序的速度。

测序的报道很多,如用短寡核苷酸引
6化学研究与应用 第13卷　
物库测DNA序列[24]、高速DNA序列[25]、毛细管阵列[26]、毛细板阵列[27]等,测序的速度有了很大提高,现已有商品CE仪器测DNA序列。

在基因治疗和基因疾病诊断中需要进行DNA基因突变测定,运用CE进行SSCP(单链构象多态性分析),R FL P(限制片断长度多态性分析)等方法都可用于基因治疗。

如Kuypers等[28]用毛细管电泳法对14号和18号染色体进行R FL P分析,检测出基因的突变(二染色体DNA 交换)并且用于诊断淋巴瘤。

DNA分析对刑事工作也提供了一种可靠的方法。

从罪犯在现场遗留的毛发、唾液及其他体液或组织中提取DNA样品,对某些基因进行STR 或R FL P分析,然后与嫌疑犯DNA图谱进行比较,就有可能找到罪犯[29],这是传统的血型或指纹分析不能比拟的。

312　单细胞分析
对作为一个相对独立生物功能体的单细胞中的一些重要组分进行高效、灵敏的检测,将有助于阐明一些重要的细胞生理过程。

单个细胞的分析化学已成为分析化学前沿领域的热门课题。

对单细胞的分析有超位电极伏安法,液相色谱—电化学检测法,微型玻管电极法,微型薄层色谱法等,但由于灵敏度或选择性方面的问题,均得不到较准确的定量结果。

CE检测限低,分离效率高,已广泛用于单细胞多组分定量检测[30]。

CE在单细胞分析中的应用主要集中在神经科学领域。

早期主要以蜗牛的巨大神经细胞为分析对象,随着技术的不断完善,逐步向哺乳类动物单细胞分析过渡,分析物的种类也逐渐扩大。

Hoyt等以牛肾上腺髓质细胞为研究对象,分离检测了其中多组分[31]。

美国I OW E大学化学系Ye2 ung研究小组一直以人体红细胞为分析对象,这是目前单细胞CE分析中最小的细胞体。

单细胞内组分含量极低,发展高灵敏度检测器是关键。

质谱检测器是能为亚微克级样品提供结构信息的一种工具,通用性好,已有常压电离(A P I),快原子轰击(FAB),电子喷雾等多种接口方式用于CE—M S检测。

对某些生物活性肽的检测限达几个fm o l[32]。

CE—L IF单细胞分析的优势尚未完全展开,选择合适的衍生化试剂[33],发展高效的柱前、柱后微量衍生化手段有助于提高—检测灵敏度,尤其对细胞内多肽、蛋白质的检测。

CE—ECD亦在进一步完善。

间接安培法和还原电化学检测法[34]用于分析一些氨基酸、肽和糖类,检测限可达几个fm o l。

化学修饰电极用于分离单细胞已有报道[35]。

Ew ing等用CE—ECD测定了蜗牛单个神经元中用DNA衍生的胺类神经递质am o l的量[36]。

进样器进一步微型化也至关重要,极少量的取样对细胞损伤小,可测定单细胞中待测物的空间分布,进一步还能检测细胞亚微结构功能体内的组分和进行细胞膜结构分析,如神经细胞内囊泡或突触中神经递质的含量。

另外随着分析对象的不断扩大,对分离的要求越来越高,寻求多种分离模式,柱前预浓集或CE与其他分离手段联用将有效提高分离效率,实现单细胞中更多组分的分析。

313　手性分离
手性药物的立体选择性差异已被证实,但长期以来多数手性药物以消旋体供药,这显然会给治疗带来严重影响,因此手性对映体分离有巨大的实用价值。

这本是H PL C的强项,但其耗费较大,需使用昂贵的特殊固定相并将大量手性试剂加入流动相。

而CE所使用的毛细管价格较低,使用溶剂只需要几m l。

已有多篇这方面的综述报道[37～39]。

手性分离分为间接拆分和直接拆分,用CE 直接拆分是发展方向。

在机理上已提出手性对映体分离模型[40]。

V igh等基于多种平衡推导出的计算公式,可研究pH值、手性选择剂浓度、电渗流对分离和选择性的影响[41]。

V altcheva等用CE 以纤维素酶为手性选择剂分析了5种Β受体阻断剂,而使用聚合物填料的H PL C时,无论是将此手性选择剂固定化还是添加在流动相中均没有获得手性分离[42]。

A bu shoffa等发现CZE使用Β-CD可拆分奥沙尼喹(oxam n iqu ine)对映体,但采用Β-CD键合的手性柱和将Β-CD及H P-Β-CD作为流动相添加剂用C18柱的H PL C均未能拆分此化合物[43]。

Shepp ard等采用CE—M S联用技术,对尿液中加入的T abu taline对映体进行了测定,检测灵敏度已达药物在体液中的实际浓度[44]。

目前对定量分析方法(包括准确度、精密度、检测限、线性范围等)的研究取得了很大进展,测定对映异构体杂质的含量已可低至011%[45,46],已有用分子模型软件研究手性拆分剂选择的报道[47],但由于方法限制,还没有用于
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　第1期 毛煜等:毛细管电泳技术和应用新进展
手性制备的报道。

314　小分子离子分析
毛细管电泳在发展初期主要用于生物大分子的分离分析,但随着生物技术向各领域的渗透,小分子离子的CE在90年代发展起来了。

无机离子可采用UV检测,但许多离子在可见光区无明显吸收,因此电化学方法也被较多地用于无机离子的测定[48～50]。

对阳离子分析,一般在缓冲溶液中加入络合剂来改变离子电泳迁移率,提高分离选择性并增加灵敏度[51]。

Ito等报道在碱金属离子、碱土金属离子的CE分析中改进措施,用肌酸酐作为背景吸收物质(254nm),在缓冲液中加入聚乙二醇和酒石酸以提高分离效率[52]。

对阴离子分析要加入CTAB等阳离子表面活性剂作为电渗流改性剂,使阴离子迁移方向与电渗流方向相同,且因电迁移速率不同而得以分离。

这种改性剂对分离影响颇大[53～55]。

Cooper等研究了影响阴离子定量分析的各种因素[56]。

有报道在2.9m in内分离了36种阴离子[55],在1.8m in内分离了19种阴离子[57]。

无论柱效及时间均优于离子色谱。

CE还可分析I C无法分离的强氧化性离子(S2O2-8)和强还原性离子(S2-),解决了用原子吸收光谱和I C均无法解决的难题[58]。

小分子的检测,如环境分析中经常碰到的污染物多环芳烃(PA H s)。

N guyen等[59]将固定相微提取(SPM E)与环糊精CE系统结合,对16种EPA(美国国家环保局)优先考虑的PA H s进行了分离,检测限达8×10-9～75×10-9g L。

Yan 等[60]运用反相填充柱系统研究了CEC梯度技术,成功地分离了16种PA H s,他采用双进样口、双溶剂、双电场,通过自动控制的双电场调控进样口两种溶剂的比例。

这项新技术可望解决pH梯度、离子强度梯度等CE应用中的问题。

CE还可用于元素形态分析。

Sch leger[61]用CTAB修饰石英毛细管内壁,在缓冲液中加入CH ES和T riton X2100,用CZE分离了A s和Se 的各种价态的化合物,并用电导检测,可检测到0.06m g L。

对研究污染物的消除、吸收和传播这些与元素形态密切相关的问题有很大帮助。

CE 在小分子离子分析方面的独到之处已被广泛用于环境、地质及食品分析行业。

总之,CE是一门发展中的分析化学前沿学科,从客观角度来看,CE的纳升级进样使得在定量的再现性上需要改进,制备电泳尚未形成规模,但我们相信凭借其高效、灵敏、快速、设备简单、广泛适用性等特点,必然会有更为广泛的应用前景。

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D EV ELO PM EN T O F CA P I LLA R Y EL ECTRO PHO R ES IS
T ECHN I QU E AND A PPL I CA T I ON
M AO Yu ,XUN J ian 2m ing
(P ri m ary M edical R esearch D epartm ent ,Second M ilitary M edical U niversity ,Shanghai 200433,Ch ina )
Abstract :R eview on recen t p rogress in the techn ique of cap illary electrop ho resis (CE )is p resen ted .
T he strong po in t and the sho rtcom ing of every m ode are discu ssed b riefly .T he app licati on of CE to DNA analysis ,single cell analysis ,ch iral separati on and i on analysis is also indicated .
Key words :CE techn ique ;gene engineering ;single cell analysis ;ch iral seperati on i on analysis
(责任编辑　李方)
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　第1期 毛煜等:毛细管电泳技术和应用新进展。