诱导多能性干细胞-张严

获取IPS细胞的基本原理

ES细胞和IPS细胞具有相同的基因。ES细胞中的与细 胞多能性有关的基因能够表达，如：oct4，Sox2等。 而已分化的体细胞中的这些基因不能表达。通过导入 与多能性有关的外源基因来激活体细胞中的多能性基 因，从而使体细胞从分化状态重编程为多能性干细胞。
iPS发展历程

iPS优点


与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不 同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有 伦理学的问题。 利用iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专用的 干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。
iPS缺点

比如，添加4个“重新编程”基因或取代疾病细胞中有 缺陷基因的方法都可能有导致癌症的副作用。
IPS细胞的应用前景

用于器官移植 建立疾病模型，了解发病机理 治疗某些遗传病 如：患有镰刀型贫血症的小鼠皮肤成纤维细胞建立了IPSc， 并将其移植到小鼠体内，小鼠的症状得以缓解。
实验方案

1. 培养小鼠骨髓间充质干细胞 2. 实验分组：对照 Fe3O4/Au RGD-Fe3O4/Au F3-Fe3O4/Au
神经干细胞 造血干细胞 间充质干细胞 内皮干细胞 ……
iPS

通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子 导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构成为胚胎干 细胞（embryonic stem cell, ESC）细胞样的多潜能细 胞。

iPS细胞不仅在细胞形态、 生长特性、 干细胞标志物 表达等方面与ES细胞非常相似, 而且在DNA甲基化方 式、 基因表达谱、 染色质状态、 形成嵌合体动物等方 面也与ES细胞几乎完全相同。
人诱导性多能干细胞鉴定 -形态鉴别和AP染色
On feeder (100×) AP staining(40×) Matrigel (200×)
扁平，较高核质比 AP染色呈阳性
qPCR检测内源多能性基因与转基因表达水平
多能性标志物的检测
甲基化水平检测与核型鉴定
拟胚体畸胎瘤形成实验验证分化潜能
2006年日本京都大学山中伸弥Shinya Yamanaka领导的实验室 在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了iPS的研究。 他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子引入小鼠 胚胎或皮肤纤维母细胞，发现可诱导其发生转化，产生的 iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细 胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与 胚胎干细胞极为相似。
人体胚胎干(hES)细胞
胚胎干细胞（ES细胞）来源于哺 乳动物胚胎发育早期的胚泡期的内 细胞团，是最原始的干细胞 优点：有潜力在体内发育成任何 细胞类型 缺点： (l)供体卵母细胞的来源困难, ES细 胞建系效率低 (2)免疫排斥反应 (3)ES细胞具有成瘤性 (4)体外保持ES细胞全能性的条件 非常复杂 (5)伦理学争论




每次用磁场处理30min，每隔4小时处理一次，共处理3天，在显微镜下实 时观察细胞的形态变化。 3. MTT 检测细胞数的变化。（酶标仪） 4. 流式细胞仪检测细胞周期。（流式细胞仪） 5. 收集细胞，用RT-PCR 检测基因的表达水平，包括: oct4, sox2, klf4, c-myc, nanog, utf1,rex1, fbxo15, dax1.（PCR仪） 6. 免疫荧光检测干细胞标志物：SSEA1，OCT4，NANOG，UTF1（荧光显 微镜） 7. NANOG，OCT4甲基化水平检测：送公司甲基化测序。


2007年末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时 报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞成为几 乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。 所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒引入 Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种因子组合，而 Thompson实验室则采用了以慢病毒载体引入OCT4、 SOX2加NANOG和LIN28这种因子组合。 这些研究成果被美国《科学》杂志列为2008年十大科技突 破中的第1位。
人诱导性多能干细胞的建立-技术流程

流程图
Cell Stem Cell,2009
人诱导性多能干细胞的建立-克隆挑取
可挑克隆-有光滑边缘，胚胎干细胞样
一次性玻璃巴 氏吸管，需制 备圆口（切割 ，剥离）和断 口（吸取）两 种
人诱导性多能干细胞鉴定

•形态鉴别与AP染色 •Realtime PCR 检测多能性基因的表达水平。 •免疫荧光鉴定胚胎标志物的表达 •多能性基因（Nanog, Oct4）启动子甲基化水平比较 •基因芯片鉴定诱导性多能干细胞与胚胎干细胞在基因表达 谱上的相似程度 •核型鉴定 •拟胚体实验验证分化潜能 •畸胎瘤实验验证分化潜能
诱导多能性干细胞
2013.09.02
主要内容
什么是诱导多能性干细胞？ 获取诱导多能性干细胞的基本原理 诱导多能性干细胞的诱导培养与鉴定 诱导多能性干细胞技术的研究进展 诱导多能性干细胞的优缺点 诱导多能性干细胞的发展历程与应用前景

干细胞

具有无限制自我更新能力、同时也可分化成特定 组织的细胞，在细胞发育过程中处于较原始阶段。 包括：胚胎干细胞 成体干细胞：上皮干细胞 造血干细胞 神经干细胞 肌肉干细胞
Biblioteka Baidu
2009年，中国科学家于2008年11月利用iPS细胞培育 出小鼠——“小小” 中国科学院动物研究所周琪研究员和上海交通大学医 学院曾凡一研究员领导的研究组合作完成的工作表明， 利用iPS细胞能够得到成活的具有繁殖能力的小鼠，从 而在世界上第一次证明了iPS细胞与胚胎干细胞具有相 似的多能性。科学家表示，这一研究成果表明iPS干细 胞或许同胚胎干细胞一样可以作为治疗各种疾病的潜 在来源。



国际学术权威杂志Science杂志刊登了北京大学生命科学学 院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队在生命科学领域 的一项革命性的研究成果——用小分子化合物诱导体细胞 重编程为多潜能干细胞。该成果开辟了一条全新的实现体 细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病带 来了新的可能。 在这项研究中，邓宏魁团队仅使用四个小分子化合物的组 合对体细胞进行处理就可以成功地逆转其“发育时钟”， 实现体细胞的“重编程”。使用这项技术，他们成功地将 已经特化的小鼠成体细胞诱导成为了可以重新分化发育为 各种组织器官类型的“多潜能性”细胞，并将其命名为 “化学诱导的多潜能干细胞（CiPS细胞）”。
诱导性多能干细胞的安全性-成瘤风险
不同组织来源的 iPSC 神 经 分 化 效 率不同，移植的神 经 球 成 瘤 效 率 iPSC 比ESC高。 不同来源和方法来 的iPSC 神经分化 能力各不相同， 都 不 如 ESC 的 分 化效率。
Zhang S.C. 2010 PNAS
Yamanaka S. 2009 NBT

成体干细胞

成体干细胞是指存在于一种 已经分化组织中的未分化细 胞，这种细胞能够自我更新 并且能够特化形成组成该类 型组织的细胞。成体干细胞 存在于机体的各种组织器官 中。成年个体组织中的成体 干细胞在正常情况下大多处 于休眠状态，在病理状态或 在外因诱导下可以表现出不 同程度的再生和更新能力。



2008年，哈佛大学George Daley实验室利用诱导细胞重 新编程技术把采自10种不同遗传病患者病人的皮肤细胞转 变为iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、药物筛选等方面 发挥重要作用。 美国科学家还发现，iPS可在适当诱导条件下定向分化，如 变成血细胞，再用于治疗疾病。 哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞发育过 程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分泌细胞，可 以直接使其转变成与干细胞极为相似的细胞，并且可以分 泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利用诱导重新编程技术 可以直接获得某一特定组织细胞，而不必先经过诱导多能 干细胞这一步。