微生物与发酵工程实验讲义 2012级

实验一 微生物显微镜直接计数法—血细胞计数板法

一、目的要求

1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图。

血细胞计数板构造

A.正面图；

B.纵切面图

（此处向下可用）计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图10-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图10-2）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。每一个大方格边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm ，所以计数室的容积为0．1mm3（万分之一毫升）。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml 菌液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A ，菌液稀释倍数为B ，那么，一个大方格中的总菌数 因1ml=1cm3=1000mm3，

故1ml 菌液中的总菌数=

B A

⨯⨯⨯410255

=50000A·B （个）

同理，如果是16个中方格的计数板则

1ml 菌液中的总菌数=

B A

⨯⨯⨯410164

=40000A·B （个）

三、器材 1.菌种 酿酒酵母

2.仪器或其他用具血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。

四、操作步骤

1．菌悬液制备

将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗吹干后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。

4．显微镜计数

静止5分钟后，将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱要适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

5．清洗血球计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

五、实验报告

1．结果

将结果记录于下表中。 A表示五个中方格中的总菌数； B表示菌液稀释倍数。

2．思考题

根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？

实验二发酵菌种的自然选育

一、实验目的

1.学习从土壤中分离工业微生物菌株的方法

2.学习无菌操作技术。

二、实验原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化，方法有许多种。

1.倾注平板法。首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50℃左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。

2.涂布平板法。首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。

3.平板划线法。最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。

4.富集培养法。富集培养法的方法和原理非常简单。当我们所要的微生物含量很低的时候，我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。

5.厌氧法。在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。

本实验欲筛选的菌土壤中含量可能很低，所以先进行富集培养以增大其浓度，然后用选择培养基平板进行分离筛选。

三、实验材料和用具

1.器材

高压蒸汽灭菌锅，恒温干热灭菌箱，超净工作台，电子天平，电炉，量筒，玻棒，三角瓶，培养皿，称量纸，药勺，记号笔，牙签，接种环，涂棒，PH试纸，移液枪，EP管，枪头

2.药品

蛋白胨，牛肉膏，氯化钠，琼脂，无菌水

3.材料

土壤样品

四、操作步骤

1.采样

采取土壤样品（在不同地点采集的样品）。

2.培养基的制备

制备营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，加水至1000ml，调PH7.2～7.4。高压