乳酸的发酵与提取耦合工艺

中图分类号：TQ921.3；文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2004)02-0017-07
乳酸的发酵与提取耦合工艺
卢金照 高年发 杨枫 卢小林
（天津科技大学生物工程系，天津 300222）
摘要：本文提出了利用木炭吸附固定化乳酸菌发酵，耦合离子交换树脂从发酵液中分离出乳酸的新工艺。

此方法成功的消除了产物乳酸对乳酸菌生长和发酵的抑制作用，使发酵时间由72小时缩短到48小时，乳酸的体积生产率由1.3g/h.L上升到1.79g/h.L 关键词: 乳酸；固定化；离子交换树脂；耦合发酵
发酵和生物反应过程很多是受产物抑制的过程，若不及时将产品分离，发酵和反应进程将无法持续下去。

乳酸发酵就是一个典型的产物抑制性发酵过程。

传统的乳酸生产方法主要是间歇式钙盐发酵法(1)。

随着生物技术的发展，为了适应产物抑制性过程实现高效连续发酵和反应，开发将发酵、生物反应和分离过程结合在一起的发酵-分离、生物反应-分离体系已成为国内外的研究热点(2)。

各种各样的分离方法正在被引入发酵和生物反应器中。

例如、可用含载体的支撑液膜分离发酵产物，但这一方法因支撑液膜的稳定性问题尚未解决而难以实用(3)。

又如，可将发酵液引出罐外通过萃取分离产物，但由于发酵液中蛋白产生的乳化现象使分相困难，这一技术也尚难进展(4).从工业化生产的角度看，离子交换树脂法以其选择性高、交换(吸附)容量大、简便、易于自动控制等优点而具有较强的竞争力(5)。

本文提出了吸附固定化德氏乳杆菌细胞与离子交换耦合发酵-分离乳酸的方法，该法以木炭为载体吸附固定化菌种发酵生产乳酸，用离子交换树脂从发酵液中分离出乳酸。

分离出产物乳酸后的发酵液返回反应器循环利用。

成功地消除了产物的反馈抑制作用，在不加中和剂（CaCO3）的情况下缩短了发酵时间．由于不加中和剂，省去了酸解、过滤过程，简化了生产工艺。

1 材料与方法
1.1 主要实验材料
（1）菌种：德氏乳杆菌（L.delbrueckii 河南金丹有限公司赠送）
（2）培养基
斜面保藏培养基：葡萄糖5％，酵母膏1％，1％，琼脂2％，pH自然；
收稿日期：2004-1-9
种子培养基（g/L）：大米糖化液80，麸皮10，CaCO3 55；
发酵培养基（g/L）：大米糖化液100，麸皮20，CaCO3 55。

1.2 分析方法
葡萄糖测定：SBA-40A乳酸-葡萄糖分析仪
乳酸测定：NAOH滴定
乳酸钙测定：EDTA滴定(1)
菌体测定：分光光度计法
1.3 实验方法
1.3.1 树脂预处理及装柱
选用M1阴离子交换树脂，树脂先用蒸馏水浸泡24h，再用2N HCL浸泡24h用蒸馏水洗至中性．然后用2N Na0H浸泡24h，水洗至中性，装柱。

填充柱尺寸为φ50×400mm，填充经预处理过的树脂500g，与发酵反应器，用于分离乳酸。

1.3.2 菌种固定化方法
木炭90℃下电热鼓风干燥箱烘干1h，以起到灭菌效果，然后冷却到室温，称取3g，加入到100ml种子培养基中，接种10%菌液，培养24h后接入发酵培养基中。

1.3.3 大米粉水解糖液制备
把500g大米粉加入到2000ml水中，加入1.5g α-淀粉菌，搅拌均匀，在80～90℃下保温30min，降温到50~60℃，加1.5g糖化酶保温60min，得到大米糖水解液。

1.3.4 分批“钙盐法”发酵
发酵反应器容积为250m1，实际工作容积为200mI，发酵温度45-50℃，发酵时间72h。

1.3.5 固定化发酵
发酵反应器容积为250m1，实际工作容积为200mI，发酵温度45-50℃，发酵时间72h。

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1.3.6 耦合发酵：固定化细胞耦合发酵的装置如图1。

图1 耦合发酵装置图
2 结果与讨论
2.1 固定化生产乳酸条件的优化
2.1.1 木炭添加量的确定
如图2所示，研究了木炭添加量分别为1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%时固定化细胞的发酵情况，结果表明，木炭的适宜添加量为3%。

图2 木炭添加量对固定化发酵的影响
2.1.2 温度对固定化乳酸生产的影响
温度时微生物培养和发酵的一个重要因素，研究了温度对固定化细胞生产乳酸的影响，如图3所示发现适宜的温度为48℃。

图3 温度对固定化发酵产酸的影响
2.1.3 底物浓度对固定化发酵乳酸产量的影响
底物浓度对固定化生产乳酸影响较大，浓度太大，
会增加溶液的渗透压，影响微生物的生长和发酵产物
的形成，并且延长发酵时间，降低转化率，我们研究了底物浓度分别为6%、8%、10%、12%、14%时的发酵情况。

结果见表1，适宜的大米糖化液浓度为10.0%.
表1 底物浓度对固定化发酵乳酸产量的影响 大米糖化液
6% 8% 10% 12% 14%
发酵时间（h ）60 68 72 78
82 乳酸转化率
95% 94% 94% 91% 88% 2.1.4 麸皮含量对乳酸生长的影响
图4 麸皮添加量对固定化发酵的影响
乳酸菌的营养要求很复杂,其生长需要多种氨基酸、维生素，添加酵母膏在工业生产上成本过高，不予考虑。

麸皮可以很好的代替酵母膏作为乳酸菌生长和乳酸发酵的良好氮源和维生素来源。

不同含量的麸皮对乳酸生产影响的研究结果如图4所示，麸皮浓度以2%左右为宜。

综上所述，固定化细胞生产乳酸的条件为：木炭的添加量为3%，培养温度48℃，大米糖化液浓度10%，麸皮的添加量为2%。

2.2 固定化细胞发酵和分批“钙盐法”发酵的比较
图5 固定化发酵与分批“钙盐法”发酵的比较
比较研究了利用固定化细胞和分批“钙盐法”发
酵生产乳酸的时间进程，如图5所示，在发酵的初始的十几个小时内，自由细胞较固定化细胞产酸多，而此后差别逐渐缩小，最后两者的产酸量几乎相等。

2.3 离子交换树脂交换乳酸的研究
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2.3.1 树脂基本性能的测定
将阴离子树脂再生、乳酸上柱，测定交换量、H 2SO 4和NaOH 的消耗量。

结果NaOH130ml, H 2SO 4 82ml (浓度均为50 g/l),交换量148g/l. 2.3.2 葡萄糖对乳酸吸附的影响
在乳酸发酵液中，除主要产物乳酸外，还有残留的葡萄糖，因此，研究了葡萄糖对乳酸吸附的影响。

在30乳酸溶液中分别加入葡萄糖，使葡萄糖浓度分别为50 g/L ，100 g/L ，150 g/L ，考察葡萄糖对改Ｍ１树脂交换容量的影响，以纯乳酸为对照，结果表2所示：
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表2 葡萄糖对乳酸吸附的影响
葡萄糖浓度g/L 吸附温度 交换容量g/L 0 48 148.1 50 48 146.5 100 48 147.1 150 48 146.9
由表２所示，当发酵液中存在葡萄糖时，树脂对
乳酸的吸附容量几乎不变，也就是说，改M １阴树脂对葡萄糖基本没有吸附作用，使一种性能优异的树脂。

2.4 耦合发酵与分批“钙盐法”发酵的比较
耦合发酵与分批“钙盐法”发酵时间进程曲线如图6所示。

图6 耦合发酵与分批“钙盐法”发酵的时间进程
由图6所示，在分批“钙盐法”发酵过程中，通过添加中和剂CaCO 3,72h 后发酵完全。

在耦合发酵过程中，通过阴离子交换树脂及时地从发酵液中分离出产
物乳酸，有效地消除了产物的反馈抑制作用，在不添
加CaCO 3中和剂的情况下，48h 残糖降到0，发酵完全，经过加碱洗脱,并通过阳离子树脂,获得乳酸 ,提取转化率稳定在86%左右。

由于分批“钙盐法”发酵过程所得为乳酸钙，还要经过酸解等工序，最终的提取收率一般只有70%左右，所以，耦合发酵的最终提取收率要远高于常规发酵。

分批“钙盐法”发酵与耦合发酵的结果列表比较于表3所示。

表3 耦合发酵与游离细胞发酵的比较
参数 分批“钙盐法”发酵 耦合发酵 时间(h)
72 48 乳酸收率 70%左右
86% 乳酸生产率（g/h.L ） 1.3 1.79 2.5 结论
(1)选用M 1阴离子交换树脂能选择性地从发酵液中分离出产物乳酸，发酵液中的葡萄糖对乳酸的吸附几乎没有影响，这有利于发酵液的循环使用。

(2)耦合发酵提取乳酸工艺中，由于树脂及时地分离出发酵液中的乳酸，有效的消除了产物抑制，使发酵时间由72h 缩短到48h,乳酸产率为1.79 g/h.L,对糖的转化率为 86%。

(3)该法由于不添加CaCO 3中和剂，除去了“钙盐法”发酵提取的酸解、过滤工序，消除了由酸解所带来的CaSO 4废渣问题，具有很好的经济效益。

参考文献
1 王博彦,金其荣主编.有机酸生产与应用手册,2000年第一版 374-378
2
Lee C.W. and Chang H.N.;Biotech.Bioeng. 1987,29,1105 3
Christen,P .;Minier, P .and Renon ,H.;Biotech.Bioeng. 1990, 36, 116 4 Shiii, S.;Taya,M.and Kobayashi, T.; J. Chem. Eng. Jpn , 1985, 18,125
5
Aradhana, S.; Pradip, K. R ，Vikram S. Biotech. Bioeng. 1997, 39: 607~613
Coupling Technology of Lactic Fermentation and Extractive
Lu Jinzhao, Gao Nianfa ,Yang Feng, Lu XiaoLin
（Department of Bio-engineering ，Tianjin University of Science and Technology ，Tianjin 300222）
Abstract: A novel coupling method of extractive fermentation of lactic acid using immobilize L.delbrueckii in carbon was proposed. The new method successfully alleviated the inhibition to lactic acid-producting bacteria growth and fermentation. It decreased the fermentation time from 72h to 60h and production rate from 1.3g/l.h to 1.79g/l.h.
Keywords : Lactic acid; Ion-exchange resin; Immobilization; Coupling fermentation.。