质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法；

2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法；

4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法；

5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应 )

在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA ，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A. 变性：加热反应系统至95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。

B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（ 35－70℃, 一般低于模板 Tm 值的 5℃

左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。

C. 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq 酶作用下，以dNTP 为原料，引物为复

制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒 DNA 的提取与制备

(1). 碱裂解法：

染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异：

A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 均变性；

B. 当以高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

(2). 离心层析柱：

A. 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA ，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；

B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；

C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。

3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）：

A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；

B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 :

DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰

蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰

碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰

C. A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应DNA 的纯度；

A260/A280=1.8DNA 纯净

A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质

A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。

4.质粒 DNA 的酶切鉴定：

限制性内切酶是DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与

一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并

在结合位点切割双链DNA 。

5.琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于

琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带( 迁移速度与分子量的对数值成反比关系 ).

三、材料与方法：

（一）实验材料：

1. PCR

仪器： PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管

材料：菌液【大肠杆菌DH5a 菌株 ( pMD19 - T 质粒 , 含目的片段 - 绿色荧光蛋白 GFP) 】、无菌去离子水、 2×Premix Taq、引物

2.质粒 DNA 的提取与制备

仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管

材料：溶液P1（S1）、溶液 P2 ( S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（ W1）漂洗液WB （ W2）、洗脱液 EB（Eluent) 、含 pMD19 - T 质粒的大肠杆菌DH5α

3.质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）仪

器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材

料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ

4.质粒 DNA 的酶切鉴定

仪器： 1. 5ml 的 EP 管、微量加样枪

材料：无菌水、 10×M 酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA 、Hind III (15U/ul) 、 EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳

仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统

材料：电泳指示剂、 Gelview、 TBE、琼脂糖、 DNA Marker 5000 、电泳缓冲液

（二）实验方法

1. PCR

准备目的 DNA ：菌液煮沸 10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液

取 0.2 ml PCR 反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水

5.5 μl、2*Premix Taq12.5、μl引物1 (10 mol/L) 1、μl引物

2 (10 mol/L) 1、μl菌液5μl

将 PCR 反应管置台式离心机中瞬时离心

将装有 PCR 反应体系的 PCR 反应管放入 PCR 仪上进行如下操作：

①94℃预变性 5 分钟后开始以下循环②循环为94℃——30秒，50℃——30秒，

72℃ —— 1 分钟。循环为 30 次③72℃ 5 分钟④4 ℃保温

将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中

2.质粒 DNA 的提取与制备

取 1. 5ml 培养物加入 Eppendorf 管中

13000rpm x 1min，弃上清