蛋白质复性的条件及影响因素_cropped

蛋白质复性的条件及影响因素_cropped

摘要蛋白质复性是一个过程 ,存在中间阶段 ,此阶段的各种相互作用

力决定了蛋白质能否复性。蛋白质复

性要求有一定的条件 ,如 p H、温度、离子强度、蛋白质浓度等。另外多种添加剂能促进蛋白质复性 ,其中包括表面

活性剂、低浓度变性剂、分子伴侣蛋白和各种氧化还原对 ,但对于不同

蛋白质 ,因其结构及理化特性不同 ,采取不同

复性方法 ,可以使其达到最佳复性效果。

关键词蛋白质 ; 结构与复性

蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分,某些脯氨酸异构酶在含有脯氨酸的变性蛋白结构

质中被证明对复性有辅助作用。来源于不同物种中子物质 ,易受外界条件的影响发生变性。随着基因

的同一蛋白质在氨基酸排列顺序上会存在不同程度工程技术的发展 ,许多

实验通过将目的蛋白基因转入原核或真核表达体系进行表达的方法 ,得到需

要的差异 , 但其折叠方式却有很大的保守性。Wal2

3 的蛋白质 ,这大大丰富了蛋白质的来源。但这些蛋 lace 研究了来

源于大肠杆菌、人和乳酸杆菌的二氢白质 ,由于表达体系本身的原因 , 或实验过程的处叶酸还原酶的复性 ,虽然这 3 种蛋白在氨基酸顺序

理 ,多以无活性的形式存在 ,需要进行复性。因此 , 上只有 30 %相同 ,但是却具有相同的复性途径和两对蛋白质复性的研究必然的成为从基础的实验室生个中间体。蛋白质的空间结构由一系列化学键来维物工程研究到最终临床应

用过程中不可避免的一系 ,其中二硫键是维系蛋白质结构完整的重要共价步。本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研键 ,二硫键的打开或错误搭配会引起蛋白质高级结究作一综述。构的丧失 ,恢复二硫键结构是蛋白质复性的重要一

步。在蛋白质的复性过程中 ,存在一系列的结构相 1 蛋白质的结构与复

性 ,这些中间体分子表面有许多疏水基团似的中间体

蛋白质在一定的氨基酸顺序的基础上形成非常暴露 ,对聚集较敏感 ,易于形成沉淀。同时 ,分子内复杂的空间立体结构 ,其组成中的氨基酸本身的特

部氨基酸之间存在使蛋白质正确折叠的天然作用性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础 , 力 ,蛋白质的复性过程就是这些中间体向两个方向尤其是处于关键部位的氨基酸 ,对蛋白质的生物学 4 选择性的演变过程,蛋白质复性效率就取决于正功能有根本的影响 ,例如镰刀型红细胞贫血症

中血

确折叠和变性聚集之间的竞争。疏水链暴露后 ,肽红蛋白氨基酸的变

化。因此 ,能达到复性的蛋白质变性应是在保持氨基酸的基本种类和顺序不

变的基链上某些具有光吸收作用的氨基酸也暴露于溶液础上 ,由于

其他因素的影响而引起的分子高级结构中 ,会引起蛋白质紫外吸收值发生一定的变化 ,根据αβ的变化 ,如2螺旋、2折叠结构的增减 , 肽链的变性这

一点 ,可以对变复性过程中蛋白质的结构情况进舒展 ,杂乱结构的增多 ,从而使蛋白质正常的生物学行观察。蛋白质的变性过程发生是比较迅速的 ,只活性丧失。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有要几分钟 ,但复性过程却相

对较慢 ,需要几个小时 , 关系 ,例如含有巯基的氨基酸 , 最常见的

是半胱氨

因此 ,复性时要给予足够的时间。酸 ,会降低蛋白质在高温条件下的稳

定性 ,尤其在某 + 2 + 些金属离子 , Cu 、Zn等存在时 , 蛋白质对空气中 2 蛋白质复性条件1 的氧更为敏感 , 而易发生不可逆变性, 在此基础

上 ,有人通过用丝氨酸、丙氨酸替换活跃的半胱氨酸蛋白质的复性对环

境中的理化条件有很高的要 2 的方法来提高蛋白质的稳定性,这当然要在不影

求 ,复性时必须对温度、p H 、离子强度等进行严格的响蛋白质的生物学活

性的基础上才有意义。脯氨酸限制 ,同时蛋白质本身的性状也对复性效率产

生影本身存在顺反两种异构形式 ,也会影响蛋白质空间 5 响。朱慧等在

研究重组人前尿激酶复性时 ,对不

同复性条件进行实验比较 ,发现强酸强碱均不利于

(( ) ) 蛋白质复性 ,偏碱 p H8 . 6,8 . 8、低温 4 ?情况下

11 Hevehan的研究表明 , 这一比例关系需随蛋白质 ,浓蛋白质复性较好。蛋白质浓度对复性也有影响

6 度越低 ,聚集越不易发生。原因是由于蛋白质的浓度作调整 ,实验

中还原型和氧化型巯基试剂比例浓度上升时 ,分子间相互碰撞的几率增加 ,处于中间介于 3 ?1,1 ?1 之间时 ,蛋白质达到最大复性。空

12 状态的蛋白质对聚集又较敏感 ,使蛋白质趋于凝集气中的氧是很好的二硫键催化剂 ,Menzella 等的而不能正确折叠 ,已复性后的蛋白质分子则

不易发研究成功地利用空气中的氧使前凝乳酶原达到复生聚集。但是 ,实际的应用要求在高浓度下达到蛋性 ,复性中需要监测溶液 p H 值 ,而

且适量加入精氨

酸和中性表面活化剂可提高复性效率 ,这不失为一白质的复性 ,许多人尝试用改变实验步骤的方法来

克服这一问题。朱慧等将复性分步进行 ,在一定的 ,有望在大规模生产中应用的方法。种降低复性成本时间间隔下分步加入蛋白质 ,给蛋白质有效的时间利用空气中的氧复性时 ,金属离子往往被用来作为

进行低浓度下的复性 ,结果提高了复性效率 ,并比较催化剂。

7 不同的时间间隔 ,发现 60min 为最佳。周明乾等312 分子伴侣对复性的影响

( ) 在纯化白介素22 IL22和粒细胞2巨噬细胞集落刺激分子伴侣是一种较新但已屡次得以验证了的蛋

( ) 因子 GM2CSF融合蛋白时 ,对溶解变性包涵体通过白质复性辅助

剂。它能结合和稳定解链或半折叠的

() 一步稀释 80 倍和分步稀释法分别进行复性 ,前种蛋白质结构 ,降低

蛋白质聚集并有效促进蛋白质折方法目的蛋白有析出 ,回收率低 ,其原理也是通过避叠。目前已从不同来源得到多种分子伴侣并应用于

13 免高浓度的蛋白质中间体同时存在于溶液中。蛋白蛋白质复

性 ,Nam从大肠杆菌中诱导并纯化得到质分子正确折叠对溶液的离子强度也有

要求 ,适当 Dnak ,Dnaj , Grp E , Gro EL , Gro ES 5 种分子伴侣 , 它们盐浓度有利于蛋白质内部各种化学键的形成。能促进碳酸酐酶 B 的复性。分子伴侣的复性机制

8 Tayyab用 1 . 0 mol/ L KCl 显著提高了在脲素中变性与 ATP 关

系密切 , Gro EL 与目的蛋白结合后 ,随即与

9 的牛血清白蛋白的复性效率。国内孙叶芳对在大 Gro ES 结合 ,两

者共同为蛋白质肽段提供一个封闭

( ) 肠杆菌中表达的重组人骨形态发生蛋白的折叠环境 rhBMP22, 然后结合 ATP , Gro EL 结构发生改变 , 进行纯化及复性时 , 结果显示高盐不能使 rhBMP22 释放出蛋白质进行复性。另外发现 , Gro EL 还会改

14 获得良好复性 , 其他条件相同时 ,0 . 75,1 . 25 mol/ L 变蛋白质复性途径。Hsp78 存在于酵母线粒体的 NaCl 最有利于蛋白二

聚体的形成 ,活性最高 ,因中 ,具有水解 ATP 及发挥分子伴侣作用 , 在 ATP 的此 ,溶液中的盐也是蛋白复性中应考虑的一项重要参与下 , Hsp78 与

Sclp 、Mdjlp 、Mgelp 协同作用可使荧

15 (αα) 光蛋白复性。2 晶体蛋白 2crystallin是一种小因素。

() 分子量的蛋白质 16,30 kD,在所有物种中均有表 3 复性的辅助剂 16 α达。Keyang的实验中2 晶体蛋白和变性的萤光

变性后的蛋白质由于氨基酸的完整顺序没有变素酶结合后 ,在 ATP 的预

先作用后再加入 Hsp70 ,2 h 化 ,本身自然存在着向活性蛋白折叠的趋势 ,有

许多α后萤光素酶活性恢复 ,ATP 的结合引起2 晶体蛋白蛋白质用透析等方法去掉变性环境后 ,自身即可完结构的变化 ,释放出目的蛋白 ,以利于其他分子伴侣成复性过程 ,最为典型的如核糖核酸酶 ,但对多数蛋17 α发挥作用。Nathy用2 晶体蛋白对木聚糖合酶进白质来说 ,复性需要一些辅助剂的

加入。这些添加

行复性 ,并检测复性过程中蛋白质结构的变化情况 , 剂具有分子量小、

易于和蛋白质结合、较稳定、不易