特异性和非特异性猪脾转移因子的制备及其免疫活性比较
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基金项目：吉林大学大学生创新性实验计划项目（2010C81247）． 作者单位：1 吉林大学畜牧兽医学院（长春 130062）；2 吉林大学
第一医院药剂科（长春 130021）；3 山东省军区物资采 购办公室（济南 250014）． 通讯作者：张英，E-mail：zhangying636＠126．com
参照文献［4］进行。取新鲜小鼠脾脏，去脂肪，剪 碎，加适量 Hank′s 液，经 100 目筛过滤，加入分离 液，2 000 r ／ min 离心 20 min，吸出脾细胞，加适量
Hank′s 液，1 500 r ／ min 离心 2 ～ 3 min，弃上清液，用 Hank′s 液洗涤 3 次，最后用 Hank′s 液适当稀释细 胞至浓度为 5 × 106 个 ／ ml。
取免疫猪及非免疫猪脾转移因子样品，用 Han－ k′s 液配制成 1 mg ／ ml。取 3 支测定管，各加 Hank′s液 0. 1 ml 作为对照管，另 3 支测定管各加供试液 0. 1 ml， 每管加小鼠脾淋巴细胞液 0. 2 ml，37℃保温 1 h；加 入豚鼠红血球（自制）悬液 0. 2 ml，摇匀，500 r ／ min 离心 3 min，置 4℃冰箱过夜；弃上清液，每管加入固 定液 1 滴，轻轻摇匀，静置 10 min；加入染色液 2 滴， 摇匀，静置 15 min 后开始计数。显微镜视野中淡蓝 色的较大细胞为淋巴细胞，共计数 200 个，统计其中 的 E-玫瑰花环形成细胞数（结合 3 个以上豚鼠红血 球的淋巴细胞），取平均值。 1. 6 猪脾转移因子免疫学活性的检测 1. 6. 1 小鼠免疫抑制模型的复制：参照文献［5］方法。 取30 只小鼠，随机分成 3 组，每组 10 只，雌雄各半。第 1 组经腹腔注射环磷酰胺 100 μg ／ g，0. 2 ml ／ 只； 第2 组经腹腔注射生理盐水 0. 2 ml ／ 只作为对照 组；第 3 组不注射，作为正常鼠淋巴细胞组。于注射 后第 5 天经眼球采血，分离外周血淋巴细胞。 1. 6. 2 猪脾转移因子的免疫活性检测：采用 MTT 法。 取外周血淋巴细胞，用含 10％犊牛血清（购自宝泰克 公司）的 RPMI1640 培养液（购自宝泰克公司）调整 细胞浓度为 2 × 106 个 ／ ml，台盼蓝染色后检测活细 胞比例（应＞ 95％）。将细胞悬液转入细胞培养板，每 孔 150 μl，再加入 Hank′s 液稀释的 PHA，25 μl ／ 孔， 分别将免疫猪及非免疫猪脾转移因子加入不同孔 内，25 μl ／ 孔，每只小鼠淋巴细胞设 4 个平行孔，并 设空白抑制组（环磷酰胺组小鼠所分离的淋巴细胞） 和空白对照组（生理盐水组小鼠淋巴细胞）。于 37℃， 5％ CO2 条件下培养 68 h，弃上清液，加入 5 mg ／ ml 的 MTT 10 μl，继续培养 4 h；加入 DMSO 100 μl，30 min 内于酶标仪 570 nm 处测其 A 值。 1. 7 统计学分析
中国生物制品学杂志 2011 年 10 月第 24 卷第 10 期 Chin J Biologicals October 2011，Vol. 24 No. 10
·1191·
Hale Waihona Puke Baidu
TF 可分为特异性 TF 和非特异性 TF。目前，临 床已应用的特异性转移因子有乙型肝炎病毒特异转 移因子、各种肿瘤特异转移因子、流行性出血热病毒 转移因子、布氏菌转移因子、疱疹病毒转移因子、乙 型脑炎转移因子、结核菌转移因子等［2］。本文制备 了蓝耳病灭活疫苗免疫猪及非免疫仔猪脾转移因 子，并比较了二者的免疫活性，为猪脾转移因子在临 床上的应用提供实验依据。
【Key words】 Pig；Spleen；Transfer factor；Immunological activity
近年来，多种猪病频繁出现，如蓝耳病、口蹄疫、 猪瘟、乙型脑炎及伪狂犬病等，给我国养猪业带来了 巨大的损失，同时给人类健康也带来很大威胁，因此， 迫切需要一些特异性高、抗病毒能力强、疗效好的生 物制品来预防或治疗这些猪病。
1. 材料与方法 1. 1 实验动物
洁净级昆明小白鼠，6 周龄，体重 20 ～ 25 g，购 自长春生物制品研究所实验动物室。 1. 2 主要试剂
环磷酰胺购自吉林大学第一临床医院；PHA 和 MTT 购自美国 Sigma 公司；其他试剂均为国产分析 纯。 1. 3 猪脾转移因子的制备
将新鲜的免疫猪脾脏［吉林正业生物制品有限 公司生产的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDCJXA1 株）免疫 21 d 后采集的脾脏］及非免疫猪脾脏 去脂肪、被膜，充分洗净。用组织捣碎机绞碎，加入等 量生理盐水，用高速组织捣碎机于 12 000 r ／ min 匀 浆 2 次，每次 1 min，将匀浆置－20℃反复冻融 6 次 后，于 3 000 r ／ min 离心 30 min，取上清，置透析袋 内，用无热原的冷生理盐水在 0 ～ 4℃环境下透析过 夜，收集袋外透析液，即为转移因子，于－20℃保存备 用。 1. 4 猪脾转移因子理化性质的检测 1. 4. 1 蛋白浓度测定：采用 Folin 酚法［3］。 1. 4. 2 核酸测定：取 2 支离心管，各加入 2 ml 待测 的转移因子，再分别加入 2 ml 蒸馏水和 2 ml 沉淀 剂，混匀，在冰浴中放置 10 min，3 000 r ／ min 离心 10 min，稀释至 A260 值在 0. 1 ～ 1. 0 之间。选用光程 为 1 cm 的石英比色杯，测定其 A260 值。 1. 4. 3 无菌试验：按《中国生物制品规程》（1995 版） 要求进行。 1. 4. 4 热原试验：按《中国生物制品规程》（1995 版） 要求进行。 1. 4. 5 安全试验：按《中国生物制品规程》（1995 版） 要求进行。 1. 5 E-玫瑰花环试验
转移因子（Transfer factor，TF）是从淋巴细胞中 提取的一类低分子多肽与核苷酸复合物，具有传递 免疫信息、激发免疫细胞活性、调节和增强机体特异 性及非特异性细胞免疫功能、促进 B 细胞的抗体分 泌及诱导机体产生干扰素等生物活性。TF 能将供体 的细胞免疫功能特异地转移给受体，这种生物学效 应无严格的种属特异性，其能转移包括真菌、细菌、 病毒、寄生虫、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗 原的细胞免疫，是一种新型免疫制剂［1］。
【关键词】 猪；脾；转移因子；免疫活性 【中国图书分类号】 R392. 1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1004-5503（2011）10-1190-03
Preparation and Immunological Activity of Specific and Non-specific Pig Spleen Transfer Factor
【 摘要 】 目的 制备特异性和非特异性猪脾转移因子（Transfer factor，TF），并比较二者的理化特性及免疫活性。方法 采 集免疫猪和非免疫猪脾脏，采用冻融-透析法提取猪脾特异性和非特异性转移因子，检测二者的理化性质；E-玫瑰花环试验检测 二者的活性；利用环磷酰胺复制小鼠免疫抑制模型，MTT 法检测二者对小鼠淋巴细胞转化的影响。结果 特异性及非特异性猪 脾转移因子蛋白含量分别为 0. 392 和 0. 026 mg ／ ml，核酸含量分别为 1. 130 6 和 0. 987 7 μg ／ μl，无菌试验、热原试验和安全 试验均未出现异常，符合相关规定要求。特异性和非特异性猪脾转移因子均可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，增加 E-玫瑰 花环的形成率。特异性猪脾转移因子对免疫抑制小鼠、生理盐水组小鼠及正常小鼠外周血淋巴细胞转化均有明显的免疫增强作 用，与对照组相比，差异均有统计学意义（P ＜ 0. 01），且特异性猪脾转移因子的免疫增强作用显著高于 PHA 组（P ＜ 0. 01）；而非 特异性猪脾转移因子对免疫抑制小鼠、生理盐水组小鼠及正常小鼠外周血淋巴细胞转化均无明显的免疫增强作用（P ＞ 0. 05），且 明显低于 PHA 对照组（P ＜ 0. 05）。结论 特异性猪脾转移因子比非特异性猪脾转移因子具有更明显的免疫增强作用。
【Abstract】 Objective To prepare specific and non-specific transfer factor （TF） from pig spleen and compare their physio－ chemical characters and immunological activities． Methods The spleens of immunized and unimmunized pigs were collected，from which TFs were extracted by freeze-thaw-dialysis，and analyzed for physiochemical characters． The activities of the prepared TFs were determined by E-rosette formation test． Mouse model of immunosuppression was copied by using cyclophosphamide ，based on which the effect of the TFs on transformation of mouse lymphocytes was evaluated by MTT method． Results The protein contents in the prepared specific and non-specific TFs were 0. 392 and 0. 026 mg ／ ml，while the nucleic acid contents were 1. 130 6 and 0. 987 7 μg ／ μl，respectively． The TFs were qualified in sterility，pyrogen and safety tests． The TFs enhanced the phagocytic func－ tion of mouse celiac macrophages and increased the formation rate of E-rosette． The transformation rates of peripheral blood lympho－ cytes of immunosuppressive mice，normal mice immunized with physiological saline and unimmunized normal mice after treatment with specific TF were significantly higher than those in control group （P ＜ 0. 01） and those after treatment with PHA （P ＜ 0. 01）． However，non-specific TF showed no immunopotentiation to the transformation of peripheral blood lymphocytes of immunosuppressive mice，normal mice immunized with physiological saline and unimmunized normal mice （P ＞ 0. 05），of which the transformation rates were significantly lower than those after treatment with PHA （P ＜ 0. 05）． Conclusion The immunopotentiation of specific TF was stronger than that of non-specific TF.
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中国生物制品学杂志 2011 年 10 月第 24 卷第 10 期 Chin J Biologicals October 2011，Vol. 24 No. 10
【治疗制品】
特异性和非特异性猪脾转移因子的制备及其免疫活性比较
李士学 1 侍俊超 1 周微 2 袁丽 1 肖龙文 1 宋文飞 1 曹锦艳 3 张英 1
LI Shi-xue△，SHI Jun-chao，ZHOU Wei，YUAN Li，XIAO Long-wen，SONG Wen-fei，CAO Jin-yan，ZHANG Ying（△College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China）
第一医院药剂科（长春 130021）；3 山东省军区物资采 购办公室（济南 250014）． 通讯作者：张英，E-mail：zhangying636＠126．com
参照文献［4］进行。取新鲜小鼠脾脏，去脂肪，剪 碎，加适量 Hank′s 液，经 100 目筛过滤，加入分离 液，2 000 r ／ min 离心 20 min，吸出脾细胞，加适量
Hank′s 液，1 500 r ／ min 离心 2 ～ 3 min，弃上清液，用 Hank′s 液洗涤 3 次，最后用 Hank′s 液适当稀释细 胞至浓度为 5 × 106 个 ／ ml。
取免疫猪及非免疫猪脾转移因子样品，用 Han－ k′s 液配制成 1 mg ／ ml。取 3 支测定管，各加 Hank′s液 0. 1 ml 作为对照管，另 3 支测定管各加供试液 0. 1 ml， 每管加小鼠脾淋巴细胞液 0. 2 ml，37℃保温 1 h；加 入豚鼠红血球（自制）悬液 0. 2 ml，摇匀，500 r ／ min 离心 3 min，置 4℃冰箱过夜；弃上清液，每管加入固 定液 1 滴，轻轻摇匀，静置 10 min；加入染色液 2 滴， 摇匀，静置 15 min 后开始计数。显微镜视野中淡蓝 色的较大细胞为淋巴细胞，共计数 200 个，统计其中 的 E-玫瑰花环形成细胞数（结合 3 个以上豚鼠红血 球的淋巴细胞），取平均值。 1. 6 猪脾转移因子免疫学活性的检测 1. 6. 1 小鼠免疫抑制模型的复制：参照文献［5］方法。 取30 只小鼠，随机分成 3 组，每组 10 只，雌雄各半。第 1 组经腹腔注射环磷酰胺 100 μg ／ g，0. 2 ml ／ 只； 第2 组经腹腔注射生理盐水 0. 2 ml ／ 只作为对照 组；第 3 组不注射，作为正常鼠淋巴细胞组。于注射 后第 5 天经眼球采血，分离外周血淋巴细胞。 1. 6. 2 猪脾转移因子的免疫活性检测：采用 MTT 法。 取外周血淋巴细胞，用含 10％犊牛血清（购自宝泰克 公司）的 RPMI1640 培养液（购自宝泰克公司）调整 细胞浓度为 2 × 106 个 ／ ml，台盼蓝染色后检测活细 胞比例（应＞ 95％）。将细胞悬液转入细胞培养板，每 孔 150 μl，再加入 Hank′s 液稀释的 PHA，25 μl ／ 孔， 分别将免疫猪及非免疫猪脾转移因子加入不同孔 内，25 μl ／ 孔，每只小鼠淋巴细胞设 4 个平行孔，并 设空白抑制组（环磷酰胺组小鼠所分离的淋巴细胞） 和空白对照组（生理盐水组小鼠淋巴细胞）。于 37℃， 5％ CO2 条件下培养 68 h，弃上清液，加入 5 mg ／ ml 的 MTT 10 μl，继续培养 4 h；加入 DMSO 100 μl，30 min 内于酶标仪 570 nm 处测其 A 值。 1. 7 统计学分析
中国生物制品学杂志 2011 年 10 月第 24 卷第 10 期 Chin J Biologicals October 2011，Vol. 24 No. 10
·1191·
Hale Waihona Puke Baidu
TF 可分为特异性 TF 和非特异性 TF。目前，临 床已应用的特异性转移因子有乙型肝炎病毒特异转 移因子、各种肿瘤特异转移因子、流行性出血热病毒 转移因子、布氏菌转移因子、疱疹病毒转移因子、乙 型脑炎转移因子、结核菌转移因子等［2］。本文制备 了蓝耳病灭活疫苗免疫猪及非免疫仔猪脾转移因 子，并比较了二者的免疫活性，为猪脾转移因子在临 床上的应用提供实验依据。
【Key words】 Pig；Spleen；Transfer factor；Immunological activity
近年来，多种猪病频繁出现，如蓝耳病、口蹄疫、 猪瘟、乙型脑炎及伪狂犬病等，给我国养猪业带来了 巨大的损失，同时给人类健康也带来很大威胁，因此， 迫切需要一些特异性高、抗病毒能力强、疗效好的生 物制品来预防或治疗这些猪病。
1. 材料与方法 1. 1 实验动物
洁净级昆明小白鼠，6 周龄，体重 20 ～ 25 g，购 自长春生物制品研究所实验动物室。 1. 2 主要试剂
环磷酰胺购自吉林大学第一临床医院；PHA 和 MTT 购自美国 Sigma 公司；其他试剂均为国产分析 纯。 1. 3 猪脾转移因子的制备
将新鲜的免疫猪脾脏［吉林正业生物制品有限 公司生产的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDCJXA1 株）免疫 21 d 后采集的脾脏］及非免疫猪脾脏 去脂肪、被膜，充分洗净。用组织捣碎机绞碎，加入等 量生理盐水，用高速组织捣碎机于 12 000 r ／ min 匀 浆 2 次，每次 1 min，将匀浆置－20℃反复冻融 6 次 后，于 3 000 r ／ min 离心 30 min，取上清，置透析袋 内，用无热原的冷生理盐水在 0 ～ 4℃环境下透析过 夜，收集袋外透析液，即为转移因子，于－20℃保存备 用。 1. 4 猪脾转移因子理化性质的检测 1. 4. 1 蛋白浓度测定：采用 Folin 酚法［3］。 1. 4. 2 核酸测定：取 2 支离心管，各加入 2 ml 待测 的转移因子，再分别加入 2 ml 蒸馏水和 2 ml 沉淀 剂，混匀，在冰浴中放置 10 min，3 000 r ／ min 离心 10 min，稀释至 A260 值在 0. 1 ～ 1. 0 之间。选用光程 为 1 cm 的石英比色杯，测定其 A260 值。 1. 4. 3 无菌试验：按《中国生物制品规程》（1995 版） 要求进行。 1. 4. 4 热原试验：按《中国生物制品规程》（1995 版） 要求进行。 1. 4. 5 安全试验：按《中国生物制品规程》（1995 版） 要求进行。 1. 5 E-玫瑰花环试验
转移因子（Transfer factor，TF）是从淋巴细胞中 提取的一类低分子多肽与核苷酸复合物，具有传递 免疫信息、激发免疫细胞活性、调节和增强机体特异 性及非特异性细胞免疫功能、促进 B 细胞的抗体分 泌及诱导机体产生干扰素等生物活性。TF 能将供体 的细胞免疫功能特异地转移给受体，这种生物学效 应无严格的种属特异性，其能转移包括真菌、细菌、 病毒、寄生虫、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗 原的细胞免疫，是一种新型免疫制剂［1］。
【关键词】 猪；脾；转移因子；免疫活性 【中国图书分类号】 R392. 1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1004-5503（2011）10-1190-03
Preparation and Immunological Activity of Specific and Non-specific Pig Spleen Transfer Factor
【 摘要 】 目的 制备特异性和非特异性猪脾转移因子（Transfer factor，TF），并比较二者的理化特性及免疫活性。方法 采 集免疫猪和非免疫猪脾脏，采用冻融-透析法提取猪脾特异性和非特异性转移因子，检测二者的理化性质；E-玫瑰花环试验检测 二者的活性；利用环磷酰胺复制小鼠免疫抑制模型，MTT 法检测二者对小鼠淋巴细胞转化的影响。结果 特异性及非特异性猪 脾转移因子蛋白含量分别为 0. 392 和 0. 026 mg ／ ml，核酸含量分别为 1. 130 6 和 0. 987 7 μg ／ μl，无菌试验、热原试验和安全 试验均未出现异常，符合相关规定要求。特异性和非特异性猪脾转移因子均可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，增加 E-玫瑰 花环的形成率。特异性猪脾转移因子对免疫抑制小鼠、生理盐水组小鼠及正常小鼠外周血淋巴细胞转化均有明显的免疫增强作 用，与对照组相比，差异均有统计学意义（P ＜ 0. 01），且特异性猪脾转移因子的免疫增强作用显著高于 PHA 组（P ＜ 0. 01）；而非 特异性猪脾转移因子对免疫抑制小鼠、生理盐水组小鼠及正常小鼠外周血淋巴细胞转化均无明显的免疫增强作用（P ＞ 0. 05），且 明显低于 PHA 对照组（P ＜ 0. 05）。结论 特异性猪脾转移因子比非特异性猪脾转移因子具有更明显的免疫增强作用。
【Abstract】 Objective To prepare specific and non-specific transfer factor （TF） from pig spleen and compare their physio－ chemical characters and immunological activities． Methods The spleens of immunized and unimmunized pigs were collected，from which TFs were extracted by freeze-thaw-dialysis，and analyzed for physiochemical characters． The activities of the prepared TFs were determined by E-rosette formation test． Mouse model of immunosuppression was copied by using cyclophosphamide ，based on which the effect of the TFs on transformation of mouse lymphocytes was evaluated by MTT method． Results The protein contents in the prepared specific and non-specific TFs were 0. 392 and 0. 026 mg ／ ml，while the nucleic acid contents were 1. 130 6 and 0. 987 7 μg ／ μl，respectively． The TFs were qualified in sterility，pyrogen and safety tests． The TFs enhanced the phagocytic func－ tion of mouse celiac macrophages and increased the formation rate of E-rosette． The transformation rates of peripheral blood lympho－ cytes of immunosuppressive mice，normal mice immunized with physiological saline and unimmunized normal mice after treatment with specific TF were significantly higher than those in control group （P ＜ 0. 01） and those after treatment with PHA （P ＜ 0. 01）． However，non-specific TF showed no immunopotentiation to the transformation of peripheral blood lymphocytes of immunosuppressive mice，normal mice immunized with physiological saline and unimmunized normal mice （P ＞ 0. 05），of which the transformation rates were significantly lower than those after treatment with PHA （P ＜ 0. 05）． Conclusion The immunopotentiation of specific TF was stronger than that of non-specific TF.
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中国生物制品学杂志 2011 年 10 月第 24 卷第 10 期 Chin J Biologicals October 2011，Vol. 24 No. 10
【治疗制品】
特异性和非特异性猪脾转移因子的制备及其免疫活性比较
李士学 1 侍俊超 1 周微 2 袁丽 1 肖龙文 1 宋文飞 1 曹锦艳 3 张英 1
LI Shi-xue△，SHI Jun-chao，ZHOU Wei，YUAN Li，XIAO Long-wen，SONG Wen-fei，CAO Jin-yan，ZHANG Ying（△College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China）