《动物生物技术》教学课件：第五章 动物细胞工程技术
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第五章 动物细胞工程技术
细胞工程
指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培
育、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特征按照 人们的意愿进行改良和创造设计，获得细胞产品 或利用细胞体本身的技术。
➢动物细胞的培养 ➢动物细胞的融合 ➢单克隆抗体技术 ➢干细胞技术
第一节 动物细胞的培养
一、细胞培养技术
体外培养：指将活体结构成分或活的个体从体内或 其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外 环境中，让其生长和发育的方法
五、培养细胞的生长和增殖过程
细胞周期
Байду номын сангаас
连续分裂的细胞，从上一次有丝分裂结束， 到完成下一次有丝分裂所经历的过程
细胞分裂间期：有丝分裂后期G1期、复制期 S期、复制后期G2期
有丝分裂期M期
G1期
S期
G2期
M期
细胞系的生长过程
培养细胞生命期：细胞在培养中持续增殖和生长时间 原代培养期：为新鲜组织自体内取出接种培养至第一
根据细胞的寿命，分为
非致死细胞：在体外培养基中不断增殖，数目以 指数式形式增加，当细胞密度达到一定程度时， 细胞停止分裂，不再生长，但当被放到新鲜培养 基中，细胞重新生长，这样可以连续传代，这种 细胞包括癌细胞、表皮细胞和成纤维细胞
致死细胞：能在体外生存和增殖，但不能连续传 代，往往分裂几代或几十代后就会死亡，大多数 细胞属于这类细胞
获得原代细胞是一系列细胞培养的第一步
获得原代细胞的步骤：
解剖分离 培养液淋洗和切成碎片 再淋洗 酶法分离成单个细胞 离心分离后再培养
B 连续化培养
大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖， 当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老 死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系
无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能 已成为恶性细胞，本质上已是发生转化的细胞系
细胞与细胞之间的相互作用：形态发生、细胞与细 胞之间的黏着作用、接触抑制、密度抑制
细胞内的流动：信号的传导、钙离子的流动、RNA 的移动、激素受体复合物的易位
遗传学：遗传学的分析、转染、转化等
四、细胞类型
贴附生长型细胞：
成纤维细胞型细胞 上皮型细胞 游走型细胞 多形型细胞
悬浮生长型细胞
原理
细胞膜的流动性
目的
产生单克隆抗体
分类
同源融合细胞：基因型相同的细胞形成的融合细胞 异源融合细胞：基因型不同的细胞形成的融合细胞
细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生
1958年, Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾 氏腹水瘤细胞彼此融合
60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合 获得成功并培养存活
反复贴壁法
细胞克隆
由单个细胞形成的细胞群或集落 细胞株
每个细胞的遗传特征和生物学特性极 为相似和一致
可对不同群体细胞的形态和功能进行 比较和研究
七、细胞融合
又称体细胞杂交 细胞融合技术：是指在离体条件下，用人工方
法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞 通过无性方式融合为一个杂合细胞的技术，包 括病毒融合、化学融合、电融合
一般情况下，非致死细胞可直接转化为连续细胞，可 以连续增殖；而其他细胞需要经过环境适应（如啮齿 动物细胞）、杂交或基因修饰才能转化为连续细胞
细胞系：经过原代培养，细胞逐渐形成具有 相似生理即代谢特性的稳定细胞系，可供 繁殖和多次传代培养，一旦原代细胞进行 了传代培养即成为细胞系
细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用 单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单 细胞增殖形成的细胞群，称细胞株 ，细胞 株具有特殊的表型性质
细胞培养的现实意义
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹 症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等
科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面 临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾
病的治疗等
1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病 毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨 髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种 细胞，该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养 条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克 隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术
•动物细胞融合途径
物理法 ：电融合法
原代培养：单个细胞
十代左右
传代培养：原代培养细胞
40~50代左右
细胞株：
10到40、50代的细胞， 遗传物质没发生改变
细胞系：
超过50代的细胞， 遗传物质发生改变，可无限增殖
细胞的纯化与克隆
细胞纯化
自然纯化
利用某一种类细胞的增殖优势，自然淘汰
人工纯化
利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件 细胞因子依赖纯化法、酶消化法、机械刮除法、
化学法 ：PEG结合高Ca2+、pH诱导法
生物法 ：仙台病毒法
丧失感染活性
紫外线
（不感染细胞）
仙台病毒
保留融合活性 （诱导细胞融合）
次传代的阶段 传代期：在细胞整个生命期中此期的持续时间最长 衰退期：此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止
六、细胞培养的基本实验
细胞原代培养 细胞传代培养 细胞计数 细胞冻存与复苏 细胞融合 细胞转染
动物细胞培养
动物细胞分离和传代培养过程
A 获得原代细胞
原代培养：从特定功能组织器官中分离后， 无法增殖或处于稳定传代培养前动物细胞， 又叫初代细胞
二、细胞培养的优点
研究的对象是活的细胞 研究的条件可以人为的控制 研究的样本可以达到比较均一性 研究的内容便于观察、检测和记录 研究的范围比较广泛 研究费用相对经济
三、研究内容
细胞内活动：能量的代谢、DNA转录、凋亡以及蛋 白质的合成
细胞内部与细胞外界之间的作用：细胞对外界刺激 的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌
组织培养：指将活体的一小片组织放在盛有培养液 的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底 面平面移动生长的过程
器官培养：指采取某些措施使器官的原基、器官的 一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原 有结构和功能
细胞培养：指将组织块用机械方法或酶解法分离成 单个细胞，做成细胞悬液，然后进行培养、生长
细胞工程
指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培
育、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特征按照 人们的意愿进行改良和创造设计，获得细胞产品 或利用细胞体本身的技术。
➢动物细胞的培养 ➢动物细胞的融合 ➢单克隆抗体技术 ➢干细胞技术
第一节 动物细胞的培养
一、细胞培养技术
体外培养：指将活体结构成分或活的个体从体内或 其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外 环境中，让其生长和发育的方法
五、培养细胞的生长和增殖过程
细胞周期
Байду номын сангаас
连续分裂的细胞，从上一次有丝分裂结束， 到完成下一次有丝分裂所经历的过程
细胞分裂间期：有丝分裂后期G1期、复制期 S期、复制后期G2期
有丝分裂期M期
G1期
S期
G2期
M期
细胞系的生长过程
培养细胞生命期：细胞在培养中持续增殖和生长时间 原代培养期：为新鲜组织自体内取出接种培养至第一
根据细胞的寿命，分为
非致死细胞：在体外培养基中不断增殖，数目以 指数式形式增加，当细胞密度达到一定程度时， 细胞停止分裂，不再生长，但当被放到新鲜培养 基中，细胞重新生长，这样可以连续传代，这种 细胞包括癌细胞、表皮细胞和成纤维细胞
致死细胞：能在体外生存和增殖，但不能连续传 代，往往分裂几代或几十代后就会死亡，大多数 细胞属于这类细胞
获得原代细胞是一系列细胞培养的第一步
获得原代细胞的步骤：
解剖分离 培养液淋洗和切成碎片 再淋洗 酶法分离成单个细胞 离心分离后再培养
B 连续化培养
大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖， 当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老 死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系
无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能 已成为恶性细胞，本质上已是发生转化的细胞系
细胞与细胞之间的相互作用：形态发生、细胞与细 胞之间的黏着作用、接触抑制、密度抑制
细胞内的流动：信号的传导、钙离子的流动、RNA 的移动、激素受体复合物的易位
遗传学：遗传学的分析、转染、转化等
四、细胞类型
贴附生长型细胞：
成纤维细胞型细胞 上皮型细胞 游走型细胞 多形型细胞
悬浮生长型细胞
原理
细胞膜的流动性
目的
产生单克隆抗体
分类
同源融合细胞：基因型相同的细胞形成的融合细胞 异源融合细胞：基因型不同的细胞形成的融合细胞
细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生
1958年, Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾 氏腹水瘤细胞彼此融合
60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合 获得成功并培养存活
反复贴壁法
细胞克隆
由单个细胞形成的细胞群或集落 细胞株
每个细胞的遗传特征和生物学特性极 为相似和一致
可对不同群体细胞的形态和功能进行 比较和研究
七、细胞融合
又称体细胞杂交 细胞融合技术：是指在离体条件下，用人工方
法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞 通过无性方式融合为一个杂合细胞的技术，包 括病毒融合、化学融合、电融合
一般情况下，非致死细胞可直接转化为连续细胞，可 以连续增殖；而其他细胞需要经过环境适应（如啮齿 动物细胞）、杂交或基因修饰才能转化为连续细胞
细胞系：经过原代培养，细胞逐渐形成具有 相似生理即代谢特性的稳定细胞系，可供 繁殖和多次传代培养，一旦原代细胞进行 了传代培养即成为细胞系
细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用 单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单 细胞增殖形成的细胞群，称细胞株 ，细胞 株具有特殊的表型性质
细胞培养的现实意义
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹 症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等
科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面 临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾
病的治疗等
1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病 毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨 髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种 细胞，该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养 条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克 隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术
•动物细胞融合途径
物理法 ：电融合法
原代培养：单个细胞
十代左右
传代培养：原代培养细胞
40~50代左右
细胞株：
10到40、50代的细胞， 遗传物质没发生改变
细胞系：
超过50代的细胞， 遗传物质发生改变，可无限增殖
细胞的纯化与克隆
细胞纯化
自然纯化
利用某一种类细胞的增殖优势，自然淘汰
人工纯化
利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件 细胞因子依赖纯化法、酶消化法、机械刮除法、
化学法 ：PEG结合高Ca2+、pH诱导法
生物法 ：仙台病毒法
丧失感染活性
紫外线
（不感染细胞）
仙台病毒
保留融合活性 （诱导细胞融合）
次传代的阶段 传代期：在细胞整个生命期中此期的持续时间最长 衰退期：此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止
六、细胞培养的基本实验
细胞原代培养 细胞传代培养 细胞计数 细胞冻存与复苏 细胞融合 细胞转染
动物细胞培养
动物细胞分离和传代培养过程
A 获得原代细胞
原代培养：从特定功能组织器官中分离后， 无法增殖或处于稳定传代培养前动物细胞， 又叫初代细胞
二、细胞培养的优点
研究的对象是活的细胞 研究的条件可以人为的控制 研究的样本可以达到比较均一性 研究的内容便于观察、检测和记录 研究的范围比较广泛 研究费用相对经济
三、研究内容
细胞内活动：能量的代谢、DNA转录、凋亡以及蛋 白质的合成
细胞内部与细胞外界之间的作用：细胞对外界刺激 的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌
组织培养：指将活体的一小片组织放在盛有培养液 的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底 面平面移动生长的过程
器官培养：指采取某些措施使器官的原基、器官的 一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原 有结构和功能
细胞培养：指将组织块用机械方法或酶解法分离成 单个细胞，做成细胞悬液，然后进行培养、生长