真核表达系统的选择和高效表达策略

杜氏盐藻生物反应器
• 杜氏盐藻是一种单细胞真核藻类,没有细胞壁，原生质外 仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜，具有一个杯状、 大型的叶绿体,体积约占细胞的一半。 盐藻是极其耐盐的， 可以在0. 05 - 5 mol/ l氯化钠的极端环境中生存。盐藻属 于光和自养生物,能利用简单的培养基进行培养，富含β胡 萝卜素、甘油、蛋白质等。盐藻作为新型的真核生物反应 器，除了具有转录和翻译后的加工能力外，还具有经济廉 价、简单有效、安全可靠等特点。由于它能在高盐条件下 培养，所以不会污染其他的微生物，这点是哺乳动物细胞 所不及的。外源基因在盐藻中的表达主要是集中在cat、 bar、gus和egfp等报告基因上,大多为瞬时表达。目前,只 有乙肝表面抗原(HbsAg)和筛选标记bar基因能够在盐藻中 稳定表达。 盐藻作为一种新型的生物反应器,目前还不能 真正生产外源性物质。 研究者们正从强启动子的筛选、 高效转化载体的构建、最佳转化方法的确立等几方面努力， 目前已经取得了一定的成果。
杆状病毒表达系统
• 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的 真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体 蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目 的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核 表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖 基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接 近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量 的 50%; 可表达非常大的外源性基因 ( ～ 200kD); 具 有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基 因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体 蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多 外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效 表达。
真核表达系统的优点
• 真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系, 表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。
酵母表达系统
• 主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、 甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母基因表 达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生 产系统，也是目前应用最广泛的酵母表达系 统。主要有H. polymorpha、Candida Bodinii、 Pichia Pastoris三种, 其中Pichia Pastoris作 为基因表达系统使用得最多、最广泛。由于 它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最 具有发展前景的生产蛋白质的真核表达系统 之一。
转基因植物表达系统
• 转基因植物是指利用一定的手段将外源性或内源性的基因 导入到植物体内,使植物的遗传性状改变而产生的植物体。 转基因植物作为生物反应器已在药物蛋白的生产中被广泛 使用,成功表达的药用蛋白质和多肽有:人的细胞因子、表 皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克 隆抗体等. 烟草、马铃薯、大豆、香蕉、莴苣、羽扇豆等 作为生物反应器生产口服疫苗,也得到了人们的广泛关注。 转基因植物疫苗和药用蛋白的表达系统主要有农杆菌介导 的核转化系统、植物病毒瞬时高效表达载体和植物叶绿体 高效表达系统。 在研究成功的转基因植物药用蛋白中, 80%是由农杆菌介导形成的转基因植物表达系统生产。 • 在重组药物的多种表达体系中,转基因植物是最经济的。同 一种重组蛋白在植物中的生产成本是微生物发酵体系的2% -10% ,是哺乳动物细胞生产的0.1%。
哺乳动物细胞表达系统
• 与其他的真核表达体系相比,哺乳动物细胞表达的 蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎 相同且能正确组装成多亚基蛋白,但成本较高。近 年来,研究者们主要通过改造宿主细胞和基因导入 方法来提高外源蛋白的表达效率。哺乳动物细胞 表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、 SP2 /0、N IH3T3等。将外源基因导入哺乳动物 细胞内的方法,主要有化学法、电穿孔法、基因枪 法和哺乳动物病毒载体系统等。
微生物基因工程
李刚 副教授
教学内容
• 一、PCR引物的设计与实验操作技巧； 二、基因组文库的建立与筛选； 三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中 • 的应用； 四、原核表达系统的选择和高效表达策略； • 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。
五、真核表达系统的选择和高效表达策略
真核生物表达系统主要包括： 酵母表达系统、杆状病毒表达系统、哺乳动 物细胞表达系统、 转基因植物表达系统、 杜氏盐藻生物反应器等五种表达系统。 其中应用最广泛的是酵母表达系统。
酵母表达系统的优点
• ①酵母长期广泛应用于酿酒和食品工业, 不 会产生毒素, 安全可靠; ②酵母是真核生物, 能进行一些表达产物的加工, 有利于保持生 物产品的活性和稳定性; ③外源基因在酵母 中能分泌表达,表达产物分泌至胞外不仅有 利于纯化, 而且避免了产物在胞内大量蓄积 对细胞的不利影响; ④遗传背景清楚, 容易 进行遗传操作; ⑤ 较为完善的表达控制系统, 如PMA1 和PDR5 等强启动子可以介导目的 蛋白高水平表达, 表达蛋白的丰度可以达到 膜蛋白的10%;
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 酵母表达系统的优点
• 此外, 采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制 目的蛋白的表达, 如GAL1- 10( 半乳糖诱导) 、 PH05( 胞外无机磷诱导) 和HSE( 37℃温度诱导) ; ⑥生长繁殖迅速, 培养周期短, 工艺简单, 生产成 本低。 • 酵母菌用于真核基因的表达、分析, 既具有原核表 达系统生长迅速、操作简单、价格便宜等优点, 又 具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程, 因而特 别适用于大量生产真核重组蛋白, 正是由于有这些 优点, 使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能 基因组研究的前列, 是应用最为普遍的真核表达系 统之一。
巴斯德毕赤酵母表达系统
• 毕赤酵母能够成功表达出多种外源蛋白,是由于毕赤酵母 具有以下独特的优点: • (1) 能够快速繁殖和进行高密度培养; • (2) 具有强启动子- 乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,并且能 • 够严格调控外源基因的表达; • (3) 可以对外源蛋白进行类似真核的加工折叠和翻译后修 • 饰,产物从而具有天然蛋白的活性; • (4) 表达产量高,杂蛋白少,并且能够胞外分泌表达,容易分 • 离提纯; • (5) 培养条件简单,成本低。 • 毕赤酵母与最早研究的酿酒酵母相比,能够高密度培养, 容易实现工业化,并且不存在酿酒酵母的过度糖基化问题, 也不易产生免疫原性问题。