野生型PTEN诱导卵巢癌SKOV3细胞生物特性改变

【摘要】【目的】探索野生型PTEN基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响。【方法】将野生型PTEN基因克隆到pAdxsi腺病毒载体并感染SKOV3细胞。荧光镜下检测腺病毒载体对SKOV3细胞的感染效率;用CCK-8法检测细胞增殖的抑制效率;RT-PCR与WB分别检测PTEN mRNA与蛋白表达水平变化;免疫化学法与间接荧光法检测PTEN在细胞内的定位及细胞内NEDD4-1和RAD51等分子表达。【结果】稳定转染PTEN后，24 h内PTEN 分布于细胞质与核内，而72 h后则主要集中于细胞核内;显著增加细胞质内NEDD4-1和细核RAD51等分子表达。【结论】野生型PTEN可影响SKOV3细胞增殖，并诱导细胞表达RAD51与NEDD4-1分子，有利于细胞DNA修复与细胞增殖抑制。

【关键词】转染; NEDD4-1; PTEN基因

Abstract：【Objective】To explore the effect of wild-type PTEN gene on biological characteristics of ovarian cancer cells. 【Methods】The wild-type PTEN gene was cloned into pAdxsi adenovirus vector and infected into SKOV3 cells，the infected efficiency of adenovirus on SKOV3 cells was detected by fluorescence microscopy; the inhibition efficiency on cell proliferation was assayed by CCK-8; RT-PCR and WB was used to detect the level of PTEN mRNA and protein expression changes respectively; the location of PTEN NEDD4-1，RAD51 and other molecules in cell were showed by immunochemical and indirect fluorescence. 【Results】The PTEN could be observed in the cytoplasm and nucleus after 24 h of stable transfection，while after 72 h they could be presented mainly in nucleus; the transfection of PTEN could increase the expression of NEDD4-1，nuclear RAD51 molecules significantly in the cytoplasm. 【Conclusion】The wild-type PTEN can effect the proliferation of SKOV3 cells and induce expression of RAD51 and NEDD4-1 molecules，thus would contribute to cellular DNA repair and cell proliferation inhibition.

抑癌基因PTEN (phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten)编码的蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶双重特异性磷酸酶活性及脂质磷酸酶活性，它参与多条细胞内信号通路的转导，调控细胞周期，对细胞的增殖与转化等多种生物学行为有重要作用[1-2]。现已证实该基因不同位点的突变、失活和表达减少与多种肿瘤的发生、发展密切相关，成为继p53后又一个与多种肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因。近期研究显示妇科肿瘤与PTEN基因异常关系密切，其突变和缺失多发于乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等[2]。本研究将野生型PTEN基因通过腺病毒载体导入SKOV3卵巢癌细胞系中，探讨其核内外的表达对卵巢癌细胞生物学功能的影响，为卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意义的参考数据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

CCK-8为日本同仁化学研究所产品;胎牛血清购于杭州四季青生物公司;脂质体LipofectamsneTM2000为GIBCO公司产品。质粒pEGFP-N1-PTEN与人卵巢癌细胞株SKOV3由本室保存;pAdxsi腺病毒载体系统、改建的人胚肾细胞293T均为北京诺赛基因公司提供;PTEN和GAPDH引物由北京赛百盛公司合成;兔抗人NEDD4-1(neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 4 isoform 1)、鼠抗人PTEN抗体为美国Santa Cruz

公司产品;HRP标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗兔IgG抗体均购自北京生物技术有限公司;鼠抗人RAD51(DNA repair protein RAD51)购于上海锐聪科技发展有限公司。

1.2 pAdxsi-GFP-CMV-PTEN腺病毒载体的构建

首先构建pShuttle-GFP-CMV-PTEN重组穿梭质粒：EcoRⅠ/SacⅡ酶切pShuttle-GFP-CMV重组穿梭载体，CIP去磷酸化处理，回收5.1 ku载体片段，同时EcoRⅠ/SacⅡ酶切pEGFP-N1-PTEN回收目的片段;酶连切好的PTEN与pShuttle-CMV-GFP片段(PTEN前后的酶切位点分别是EcoRⅠ与SalⅠ、KpnⅠ和SacⅡ)，得到pShuttle-GFP-CMV-PTEN;转化并扩增，抽提质粒pShuttle-GFP-CMV-PTEN。再构建重组腺病毒载体质粒：Ⅰ-CeuⅠ+Ⅰ-SceⅠ双酶切处理pAdxsi骨架质粒与pShuttle-GFP-CMV-PTEN 质粒，切好的两目的片段酶连，产物转化并扩增带pAdxsi-GFP-CMV-PTEN病毒质粒的DH5a;提取pAdxsi-GFP-CMV-PTEN质粒。产物分别进行酶切鉴定与测序。

1.3 重组腺病毒包装、扩增和滴度测定

293细胞用含100 mL/L FBS的DMEM培养。待细胞长满约80%时，PacⅠ酶切线性化pAdxsi-CMV-PTEN，转染293细胞，3 ～5 d后，细胞开始出现细胞病变，待大部分细胞病变并脱落时收获，收集细胞及上清液，反复冻融3次，离心收集上清，用上清继续感染293细胞大量扩增病毒，获取大量病毒液于-80 ℃冻存备用;同时测定病毒滴度。

1.4 细胞培养与腺病毒转染及其表达

SKOV3细胞置于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中常规培养，隔天传代。Adxsi-GFP-CMV-PTEN病毒以100 PFU/cell 量加入培养瓶中，作为腺病毒载体实验组(SKOV3/PTEN)，继续培养;同时设立无腺病毒载体感染对照组(SKOV3/CON)与空病毒pAdxsi-CMV-GFP感染的对照组(SKOV3/GFP)，分别于不同阶段收集细胞，提取各组细胞总RNA，行RT-PCR检测目的基因表达情况。引物序列如下：PTEN上游5′-ACCGCC AAA TTTAA TTGCAG-3′，下游5′-GGGTCCTGAATT GGAGGAAT-3′，扩增片段长度为469 bp;内参照GAPDH上：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′，下：5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′，扩增片段长度为400 bp。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃×40 s，55 ℃×60 s，72 ℃×60 s，28个循环;72 ℃×10 min。取10 μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳并与Marker比较判断PCR产物片段大小。

1.5PTEN转染对SKOV3细胞生长的影响

SKOV3细胞进行PTEN转染后24 h胰酶消化，调整细胞为5 ×104/mL，以0.2 mL/孔移入96孔板，8孔/板，按同样方法处理SKOV3/GFP和SKOV3/CON等组细胞。从第2天开始，每天同一时间取一块板，于实验各孔分别加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃继续孵育1 h，测定吸光度值D(450 nm)，根据CCK-8测定结果分析PTEN对SKOV3生长影响。

1.6Western Blot检测