DNA的限制性酶切实验原理
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溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程 可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电 泳而得到检测。
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一、DNA的限制性酶切实验原理
2. 限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄
主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜
体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌
(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。
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常用的电泳缓冲液
常用的6X载样缓冲液 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
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4℃ 保存备用.
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三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制
与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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7
由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13
噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
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3
一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 切酶.
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切 割，产生特异的ＤＮＡ片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；
隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
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一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
➢ 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别 顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上 切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因 此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA 片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因 克隆。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能
在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推
动了分子生物学的兴学旺习和课程发项目展教。学 管理 心理学 生
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粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。
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5
平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双
链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’
3’…… CTA|TAG …… 5’
切割后形成
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’
这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
高速离心机， 电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉
实验三 质粒DNA限制性酶切图谱分析
一、DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序 的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能 犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产 生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
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一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克
Fra Baidu bibliotek
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷
酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
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（2）电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测
仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。
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❖ 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程 可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电 泳而得到检测。
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一、DNA的限制性酶切实验原理
2. 限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄
主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜
体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌
(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。
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常用的电泳缓冲液
常用的6X载样缓冲液 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
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三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制
与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13
噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
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一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 切酶.
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切 割，产生特异的ＤＮＡ片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；
隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
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一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
➢ 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别 顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上 切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因 此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA 片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因 克隆。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能
在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推
动了分子生物学的兴学旺习和课程发项目展教。学 管理 心理学 生
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粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。
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平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双
链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’
3’…… CTA|TAG …… 5’
切割后形成
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’
这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
高速离心机， 电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉
实验三 质粒DNA限制性酶切图谱分析
一、DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序 的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能 犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产 生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
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一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克
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如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷
酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
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（2）电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测
仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。
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❖ 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围
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