BPI-3016,一种新型长效hglp-1类似物,用于治疗2

BPI-3016，一种新型长效hglp-1类似物，用于治疗2型糖尿病
内容简介
胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物常用作为治疗2型糖尿病（t2dm）患者的附加药物。

目前，研发每周注射一次，具备自由度和灵活性的长效GLP-1类似物已成为主流。

在这里，我们通过对人体GLP-1进行结构性修饰，成功地研发了一个半衰期显著延长，抗二肽基肽酶IV（DPP-IV）裂解的长效人类GLP-1（7–37）类似物（BPI-3016）。

含GLP-1受体亲和力的BPI-3016体外活性研究并测定了环磷酸腺苷（cAMP）产生的刺激性。

为了了解BPI-3016的体内活性及其对血糖控制的影响，我们测量了ob/ob小鼠、db／db小鼠和和自发性糖尿病食蟹猴的β细胞质量和体重。

结果表明，结果表明，BPI-3016对GLP受体具有良好的亲和力。

并且能够刺激环磷酸腺苷（cAMP）的产生。

在体内药动学研究中，在对糖尿病食蟹猴单次给药后，BPI-3016的半衰期长达95小时以上。

此外，BPI-3016单次给药后一周时间内减少了禁食和餐后血糖水平。

在7周中，每周注射一次次后，它降低了体重指数（bmi），体脂，提高了提高葡萄糖耐受性并表现出胰岛素缺乏效应。

总之，BPI-3016保留了GLP-1的作用，显著延长了半衰期，在临床上，是每周注射一次治疗2型糖尿病的一种有希望的方法。

介绍
在2型糖尿病高血糖的进展中，β细胞功能障碍和抗胰岛素是主要的病理事件。

多种治疗剂，比如一些以恢复β细胞功能为目标的口服药或外源性胰岛素（主要是通过减少β细胞负荷或诱导β细胞休息）在最近几十年有了很大进展。

然而，很多传统的治疗2型糖尿病的方法不能显著改善β细胞功能，同时可能带来一些副作用，比如体重增加，低血糖风险和周围高胰岛素血症增加。

因此，最近很多研究致力于显著改善β细胞功能，同时避免相关副作用。

肠促胰岛素药物GLP-1类似物通过抑制胰高血糖素分泌增加胰岛素分泌来降低血糖水平，成为治疗2型糖尿病高的理想药物，因为它们通常可耐受，副作用小。

这种药物可以通过减缓胃排空，降低食欲来降低体重，并且可显著减少低血糖风险。

GLP-1在小肠和结肠远端的肠内分泌细胞中产生。

在食品摄入后，它的血浆水平迅速上升，通过促进与葡萄糖浓度相关的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，降低循环葡萄糖。

具有生物活性的GLP-1来自于以两种以等势循环分子形式GLP-1（7–37）和GLP-1（7–36）酰胺的GLP-1（1–37）。

其中GLP-1（7–36）酰胺代表GLP-1在人体血浆中的大部分循环活动。

由于二肽基肽酶和中性内肽酶作用，血液中原有的GLP-1会快速的降解，半衰期非常短。

因此，设计一种与人体原有GLP-1具有相同生物活性，但同时具有很强的抗酶分解能力的GLP-1类似物是一种具有前景的研发方向。

目前FDA批准的两种GLP-1类似物包括两个一天一次或两次注射的药物（艾塞那肽和利拉鲁肽）以及三个一周注射一次的药物（阿比鲁肽，杜拉鲁肽和长效缓释艾塞那肽注射液），这种一周内在一天任何时候注射的药物，可以避免在口服制剂中常见的食物-药物相互作用，可以减少注射次数，并有可能提高患者的依从性。

为了提升GLP-1类似物的安全性和药效，人们投入大量精力研发一周注射一次的药物。

GLP-1（7–37）和GLP-1（7–36）氨基末端Ala8的酰胺键（-NHCO-）对二肽基肽酶的分裂非常敏感。

理论上说，对GLP-1氨基末端的修饰可以带来对二肽基肽酶的抑制作用的抵抗，因此能够延长半衰期，提高药效。

在我们之前的研究报导中，通过用一种含有-CF3-的连接单元结构性地替换GLP-1（7–36）氨基末端Ala8的酰胺键（-NHCO-），我们构建了一种新的GLP-1（7–36）类似物BPI-3006。

同样地，通过结构性地替换氨基末端和34号位置的氨基酸（赖氨酸到精氨酸），并用对26号位置的带有C-18脂肪酸链的赖氨酸进行酰化反应，我们发明了一种GLP-1（7–37）类似物BPI-3016。

长脂肪酸转化为肽的共轭克服了二肽基肽酶的降解作用，通过促进与血浆蛋白的结合防止天然GLP-1肾滤过，如白蛋白，减少肾脏的排泄。

显著延长的天然GLP-1半衰期使2型糖尿病人一周注射一次成为可能。

在这个研究中，我们通过评估其对GLP-1受体的亲和力，刺激环腺苷酸的生成能力，和对二肽基肽酶降解的抵抗能力，评估了BPI-3016的体外生物活性。

此外，我们还描述了BPI-3016在三种典型糖尿病动物（ob/ob、db/db小鼠和自发性糖尿病食蟹猴）在血糖水平，胰岛素分泌，体重，葡萄糖耐量，胰腺β细胞功能方面的体内活性。

2.原料和工艺
肽类
贝达药业通过净化和表征，人工合成GLP-1、BPI-3016和NN9535（BPI-3016的肽序列见表S1），GLP-1受体结合实验由上海的辉源生物完成。

体外研究所用的GLP-1类似物利拉鲁肽由贝达药业提供，用于动物试验的利拉鲁肽（维克托萨）和注射用艾塞那肽微球（百达扬）分别从诺华和阿斯利康购买。

在所有的试验中，BPI-3016溶于0.01 M磷酸氢二钠缓冲液（ph=8～9）。

在活体研究中，用生理盐水或0.01 M磷酸氢二钠缓冲液（ph=7.96）稀释BPI-3016。

2.2。

细胞培养和细胞传染
在37℃下100 g/ml链霉素，5%（v/v）CO2加湿环境中，HEK293细胞（ATCC）在DMEM （杜尔贝科改良伊格尔培养基），10%（v/v）胎牛血清，100单位/ml青霉素中培养。

为了把人体GLP-1传染给HEK293细胞，在细胞以大约70%的融合度播种后，根据制造商的协议，使用了脂质体胺M2000制剂。

2.3。

活性配体结合法测定GLP-1受体的结合亲和力
采用竞争性放射性配体结合分析法，获得BPI-3016抑制常数Ki，反映GLP-1受体结合亲和力的参数。

感染了GLP-1受体的HEK293细胞在10 s于15 ml冰结合缓冲液（50 mM羟乙基哌嗪乙磺酸，10 mM氯化镁，100 mM 氯化钠）中均匀混合。

细胞匀浆在18000g下离心20分钟。

将含有沉淀剂的细胞膜用1毫升冰凝缓冲液重新悬浮。

肽储备溶液（1 mM）被含0.1%牛血清白蛋白（ph=7.4）连续结合缓冲液稀释。

15升肽溶液（（300 pm–10 m，10倍），15升125I-GLP-1（2.5纳米，10倍）（珀金埃尔默制造）以及120L细胞膜匀浆室温下在96孔板中培养1小时。

此外，通过用125I-GLP-1和细胞膜匀浆在96孔板中进行全结合或非特异性结合控制，培养15 L结合缓冲液或GLP-1（1 M）。

在培养完成后，反应混合物被倒入进入96孔滤板（珀金埃尔默制造）中，通过细胞收割机（过滤材料通用收割机，珀金埃尔默制造）进行过滤。

用羟乙基哌秦乙硫磺酸缓冲液洗涤3次，夜间温度保持37度去湿。

放射性（每分钟校正计数，ccpm）通过用微型板闪烁计数器（1450微珠Trilux，珀金埃尔默制造）对每孔进行分析。

根据Tobelow公式计算125I-glp-1的抑制性受体结合率：
抑制结合率（%）=（CCPM化合物−CCPM非特异性对照）×100/（CCPM总结合对照−CCPM 非特异性对照）。

利用图垫棱镜5.0对数据进行分析，用IC50计算Ki值。

2.4。

BPI-3016诱导的环磷酸腺苷生产DPB的测定
生产DPBS缓冲液[补充0.1%（w/v）BSA和0.5 mmibmx]用于将GLP-1和其他肽储备溶液稀释至200 nm。

采用三倍串联稀释法在不同浓度下获得GLP-1和BPI-3016溶液。

被恢复的Hek293/Glp1r/Cre/Luciferase细胞（辉源生物）通过以900g离心5分钟，再悬浮于DPBS缓冲液中实现收集。

然后将细胞稀释至1.6×105/ml的密度，并将（5 l）转移至384孔板。

随后将具有不同浓度（0.042 pm–200 nm，2倍）的肽（5 l）添加到细胞中。

在37℃培养30分钟后，根据方案说明，使用环磷酸腺苷动态2试剂盒（cisbio bioassays）测量环磷酸腺苷。

在enVision PlateReader（珀金埃尔默制造）上，在665 nm和615 nm处读取均相时间分辨荧光信号。

根据环磷酸腺苷标准曲线将读数转换为环磷酸腺苷浓度。

用图板棱镜5.0分析数据
2.5。

二肽基肽酶对BPI-3016的降解
在37 度温度下，中每隔0、1、8、24、32和48 小时用三（羟甲基）氨基甲烷（ph=8.0）进行水浴。

BPI-3016、利拉鲁肽和NN9535（50 m）在与从猪肾（西格玛奥德里奇提供）（100 U/L）中纯化的二肽基肽酶一起培养。

为了比较上述glp-1类似物和天然glp-1对二肽基肽酶的抗性，将glp-1（50 m）与二肽基肽酶一起孵育0、0.25、0.5、0.75和1 小时。

上述酶促反应均以添加三氟乙酸（TFA，10%）终止。

用0、1或48小时的无二肽基肽酶的样品作为对照。

将上述处理过的样品储存在−20_C下，以供将来通过色谱300-5 C4柱（阿克苏诺贝尔）评估亲本肽。

利用光电二极管阵列（PDA）紫外检测器（安捷伦技术）在214 nm处监测吸光度，并分析峰面积。

结果以亲本肽相对含量表示。

2.6。

动物
为测定BPI-3016体内药效，从上海药物研究所获得60只OB/OB（b6.cg-lepob/j，30-45 g）和12只野生型小鼠（15-25 g），雌雄各半；32只雄性DB/DB以及8只6-8周龄的M/M小鼠从南京大学模型动物研究中心采购。

每笼饲养一只小鼠，并保持在无特定病原体（SPF）的实验动物室。

（23.0±1.0 C，50–70%相对湿度，12小时亮/暗循环）。

ob/ob小鼠采用高脂周喂，其他类型小鼠均采用标准周喂。

所有小鼠都随意用消毒水喂养。

38只雄性自发性糖尿病食蟹猴（空腹血糖：94–300 mg/dl，糖化血红蛋白（HbA1c）≥4%，葡萄糖<2%）从昆明亚灵生物科技有限公司购买6只体重7-15公斤、年龄13-23岁的正常食蟹猴。

单独安置在
受控环境中（18–29_C，30–70%相对湿度，12小时光/暗循环）。

糖尿病和健康的猴子被喂食固定量的标准饮食。

所有动物研究均按照《中华人民共和国实验动物标准》（GB14925-2001）进行。

昆明生物医学国际（KBI）机构动物保护与利用委员会（协议号KBIK001115002-01,01）批准了该研究。

2.7。

自发性糖尿病食蟹猴的药代动力学
自发性糖尿病食蟹猴接受单次皮下注射0.2 mg/kg BPI-3016，然后在−2（给药前）、2、8、22、46、94、118、142和166小时采集血样，这些血样给药后储存在−80 C进行分析。

用电喷雾电离法测定了BPI-3016各时间点的血浆浓度。

色谱分离系统由保护柱（C18，Phenomenex）分析柱（XB-C18，Phenomenex）和5 mM乙酸铵（A相）和乙腈（B相）的梯度流动相组成。

所有分析数据均由分析员软件（版本1.6，AB Sciex）处理。

BPI-3016的药动学参数来源于与Phoenix（版本1.3，Pharsight）的非区域分析。

2.8。

血糖和胰岛素水平测量
7周龄ob/ob小鼠随机分为5组（n=12/组）。

12只野生型小鼠作为正常对照组。

为了具体说明BPI-3016的短期效果，在皮下注射生理盐水（溶媒对照），BPI-3016（0.5，1，2 mg/kg），或利拉鲁肽后，随机监测0、2、4、6、10、24、30、34和48小时的血糖水平。

为了评估BPI-3016的长期效果，在31天内每隔一天皮下注射生理盐水和BPI-3016（跳过第21天）。

分别给予利拉鲁肽（0.1 mg/kg，阳性对照），同一时期每天两次（不停药）。

通过Accu-Chek®Performa血糖仪（罗氏诊断）。

测定了ob/ob和野生型小鼠的随机血糖水平。

用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Crystal Chem）测定了30天ob/ob小鼠空腹血清白蛋白水平。

DB/DB小鼠随机分为4组（n=8）：对生理盐水（媒剂对照）、低剂量和高剂量BPI-3016和NN9535进行了相应的治疗。

8周内每隔一天给动物皮下注射一次媒剂（生理盐水）、BPI-3016（0.2，0.5 mg/kg）或NN9535（0.2 mg/kg）。

8m/m，生理盐水治疗，作为正常对照。

在本实验中，用Accu-Chek®积分血糖仪（Roche诊断仪）测量各组的空腹血糖水平。

根据体重，空腹血糖，糖化血红蛋白水平和葡萄糖，38只自发性糖尿病食蟹猴随机分为5组：糖尿病对照组（n=8）用磷酸盐缓冲液治疗。

阳性对照组（n=8）接受0.15 mg/kg 艾塞那肽，另外三组分别接受0.1 mg/kg（n=6）、0.2 mg/kg（n=6）和0.4 mg/kg（n=10）的BPI-3016。

另外，选择6只同年龄、血糖正常的肥胖猴作为正常对照组，并用载体进行治疗。

所有动物每周接受一次皮下注射7次。

监测糖尿病和正常食蟹猴的空腹和餐后血糖水平。

第
七次给药前由罗氏COBAS C311全自动生化分析仪进行。

糖化血红蛋白
2.9。

糖化血红蛋白水平的测量
在为期8周的db/db小鼠研究中，在第0天和第8周用NYCOcard reader II hbA1c检测器（轴屏蔽）测量糖化血红蛋白。

用罗氏c311生化分析仪采集糖尿病猴血液标本，分别于术前、术后6次测定糖尿病猴的糖化血红蛋白（HbA1c）水平。

2.9。

HbA1c水平的测量
在为期8周的db/db小鼠研究中，在第0天和第8周用NYCOcard Reader II HbA1c检测器（轴屏蔽）测量HbA1c。

用罗氏c311生化分析仪采集糖尿病猴血液标本，分别于术前、术后6次测定糖尿病猴的糖化血红蛋白（HbA1c）水平。

2.10。

自发性糖尿病食蟹猴的糖耐量
在对食蟹猴的研究中，进行给药前和给药后对静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）。

第7次治疗后22小时进行给药后IVGTT。

动物禁食16小时后麻醉，采集血样进行基础血糖测定。

然后根据猴子的体重（0.5g葡萄糖/kg体重）静脉注射50%的葡萄糖溶液。

在静脉葡萄糖负荷完成后1、3、5、10、20、40和60分钟采集血样，测量血糖和胰岛素水平。

通过计算外源性葡萄糖负荷后10-40分钟内葡萄糖消失率(KGlucose)来评估葡萄糖耐受性：
葡萄糖=（Glu10 min−Glu40 min）/30 Glu10 min.
2.11。

自发性糖尿病综合征猴子的体重指数和体脂测定
在每只动物7次给药前和给药后评估体重指数（bmi，kg/m2），体重除以身高的平方。

7次给药前后用双能X射线吸收仪（DEXA）进行全身扫描两次，使用Hologic Discovery Qdrseries （马萨诸塞州贝德福德）密度计测量体脂。

动物用唑来替（3mg/kg，im）镇静，然后固定在dexa床的扫描区域内进行扫描。

根据已建立的指导方针，用Hologic身体成分分析软件对猴子的全身和局部身体成分进行了分析。

2.12。

β细胞团的组织学评价
9只来自对照组、BPI-3016和利拉鲁肽组的雄性ob/ob小鼠被牺牲以获得他们的胰腺，固定在10%甲醛中并嵌入石蜡中。

胰腺从头部到尾部切成3微米厚的切片。

对四个胰腺代表
性截面（连续35个截面的第一个样本）进行胰岛胰岛素染色。

切片用二甲苯脱蜡再水化。

然后用正常山羊血清（5%，v/v）阻断45分钟。

随后用豚鼠多克隆抗胰岛素抗体（ABCAM；1:100）和用过氧化物酶（abcam；1:150）标记的兔多克隆抗豚鼠IgG抗体作原发性和继发性抗体。

然后，用Tris缓冲盐水冲洗切片，并用二氨基联苯胺底物溶液覆盖15分钟。

然后再次清洗切片并用苏木精复染。

使用尼康显微镜观察并使用图像J软件（美国国立卫生研究院）进行分析。

β细胞质量按固定前胰腺细胞面积百分比和胰腺重量计算，公式如下：
β细胞质量（mg）=[免疫染色面积/总切片横截面积×100%]×胰腺重量（g）×1000
β细胞质量的重量百分比=β细胞质量（mg）/[1000×体重（g）] ×100%。

将载药对照组、BPI-3016和利拉格鲁潮汐组的9只雄性ob/ob小鼠处死，取其胰脏，经孵育，固定于10%甲醛中，石蜡包埋，从头部至尾部切成3米厚的切片。

每个胰腺的四个代表性切片（连续35个切片的第一个样本）被用于胰岛胰岛素染色。

切片被二甲苯脱皮。

2.13。

统计分析
统计分析所有数据均表示为平均值±SEM。

采用student-t-检验对ob/ob小鼠实验数据进行分析。

采用单因素方差分析（dunnett'stest）和独立t检验（spss statistics 19.0，IBM）对DB/DB 微实验数据进行分析。

在猴子实验中，数据通过单因素方差分析（LSD-T-TEST）、独立t-TEST 和Kruskal-Wallistest进行统计分析，必要时使用统计软件SAS9.3.。

3.结果
3.1。

BPI-3016的体外药理作用
为了评价BPI-3016的生物学活性，首先测定了BPI-3016与GLP-1受体的结合能力。

表1肽对二肽基肽酶体外降解的抗性。

将50 M glp-1、bpi-3016、利拉鲁肽和nn9535与二肽基肽酶（100 U/L）在37°C的温度下，在不同的时间间隔内从猪肾中纯化。

然后通过添加10%的TFA终止反应。

通过分析色谱图中的峰，使用高效液相色谱系统（包含pda紫外检测器）在214 nm处监测每个肽的吸光度。

亲本肽相对含量与0小时峰面积比较，以百分位数表示。

a表示考虑到必要性，未对样品进行化验。

结果表明，与GLP-1（Ki=1.2 nM）相比，BPI-3016与GLP-1受体具有较低的结合亲和力（Ki=19.4 nM）（图1a）。

此外，BPI-3016显示剂量依赖性刺激对环磷酸腺苷的产生有影响，EC50在1.80纳米，而本地GLP-1的EC50为0.10纳米（图1b）。

此外，BPI-3016在体外对二肽基肽酶的耐受性较利拉鲁肽和NN9535分别为46.65%和89.80%，在48小时孵育后有98.97%的外肽残留，而二肽基肽酶对GLP-1的降解很快，1次孵育后仅有5.22%的外肽残留（表1）。

在不含二肽基肽酶、BPI-3016、利拉鲁肽、NN9535和GLP-1亲本肽的同一反应体系中，BPI-3016的体外稳定性分别为96.87%、87.26%、100.90%和97.99%（表2）。

图1
图1。

BPI-3016的体外药理学特征
a）未标记的GLP-1、BPI-3016、利拉鲁肽和NN9535（30 pm–1 m）的结合亲和力随着浓度的增加而增加，这可以通过取代放射性标记配体125I GLP-1（0.25 nm）的结合来证明。

b）通过增加GLP-1、BPI-3016、利拉鲁肽和NN9535（0.021 pm–100 nm）的浓度，HEK293细胞对刺激的细胞内环磷酸腺苷反应。

数据表示为平均值±SEM，n=2。

3.2。

BPI-3016对ob/ob小鼠具有长效葡萄糖调节作用，提升β细胞质量，促进胰岛素分泌。

用溶媒、BPI-3016（0.5、1、2 mg/kg）和利拉鲁肽治疗ob/ob小鼠48小时，测定其随机血糖水平，以评价BPI-3016在48小时内的血糖调节作用，结果表明，单次剂量治疗0.5、1和2 mg/kg BPI-3016后，随机血糖水平与溶媒对照组相比降低了36.2%、41%和49.2%。

在34 h内（P<0.001），给药48 h后，ob/ob小鼠随机血清葡萄糖水平在19.8%和22.2%。

在给药1和2 mg/kg BPI-3016（p<0.05），表明BPI-3016显著降低血糖水平（图2a，表s2和s3）。

图2
图2。

BPI-3016具有长效的葡萄糖调节作用，增加了ob/ob小鼠的细胞质量，促进了餐后胰岛素分泌。

a）单剂量BPI-3016显著降低了ob/ob小鼠的随机血糖水平：单剂量S.C.给予0.5、1、2 mg/kg BPI-3016后，随机血糖水平显著降低。

给药后2、4、6、10、24、30和34小时（**P<0.001、0.5、1、2 mg/kg BPI-3016组与对照组比较）（n=12/组）。

b）皮下注射0.5、1、2 mg/kg bpi-3016 14次，ob/ob小鼠随机血糖水平显著降低（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；0.5、1、2 mg/kg bpi-3016组与对照组比较）（n=12/组）。

c）在Nikon显微镜下（×40）观察了ob/ob小鼠31天长期注射1 mg/kg bpi-3016和利拉鲁肽的胰腺切片，分析了胰岛素阳性细胞的特征。

d）BPI-3016（1 mg/kg）组细胞质量明显增加（*P<0.05，与对照组比较）（n=3/组）。

e）中剂量BPI-3016组细胞质量的重量百分比也明显高于对照组（*P<0.01，与对照组比较）（n=3/组）。

f）单剂量0.5、1、2 mg/kg bpi-3016与对照组相比，显著增加ob/ob小鼠餐后胰岛素分泌（*p<0.01、0.5、1、2 mg/kg bpi-3016组）（n=12/组）。

给药后2h用酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清白蛋白水平。

数据表示为平均值±SEM。

用BPI-3016给药，每两天一次，观察31天内ob/ob小鼠随机血糖水平的变化，以表明其长期作用。

与溶媒对照组相比，BPI-3016组第4次给药后随机血糖水平显著降低（P<0.05，
P<0.01，P<0.001）。

为了明确评价BPI-3016长期给药后降低血糖水平的效果，在注射前和注
射后第10次给药（24、48、72和96 h）测定各组随机血糖水平。

结果表明，0.5、1和2 mg/kg BPI-3016即使在给药后96 h仍能显著降低血糖水平（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。

此外，与单次注射BPI-3016相比，多次注射的慢性BPI-3016治疗在初次注射后48小时诱导的随机血糖水平显著降低（0.5 mg/kg:10.2%对36.2%；1 mg/kg:19.8%对42.3%；2 mg/kg:22.2%对42.3%），提示持续交替的皮下注射0.5、1和2 mg/kg BPI-3016连续14次可显著降低随机血糖水平，其作用是长效的（图2b，表S4和S5）。

为了研究注射1 mg/kg BPI-3016是否能增加ob/ob小鼠的细胞质量，我们用尼康显微镜对胰腺切片中的胰岛素阳性细胞进行了分析。

我们发现，经过31天的bpi-3016处理后，ob/ob 小鼠的-细胞质量（图2c和d）及其重量百分比（图2e）比对照组（9.70 mg vs6.98 mg，p<0.05；
0.021%vs 0.013%，p<0.01）显著增加。

作为阳性对照组，利拉鲁肽也显著增加。

细胞质量（11.32mg vs 6.98mg；P<0.05）和重量百分比（0.023%vs 0.013%；P<0.001）显著增加。

为了确定bpi-3016对胰岛素分泌的影响，在治疗后测量ob/ob小鼠的餐后血清胰岛素水平（图2f）。

0.5、1、2 mg/kg BPI-3016组血清胰岛素水平分别达到52.68、55.60和62.11 ng/ml，明显高于对照组（36.93 ng/ml）（P<0.01）。

另外，利拉鲁肽组（57.85ng/ml）血清胰岛素水平也明显升高（P<0.01）。

表2
未经二肽基肽酶处理的肽的体外稳定性。

图3
图3。

长期治疗BPI-3016可改善db/db 小鼠的血糖控制，分别于0、2、4、6、8周测定db/db 小鼠的空腹血糖水平。

第0周和第8周检测到HbA1c 水平。

a）BPI-3016对空腹血糖的影响：用0.2和0.5 mg/kg的BPI-3016（s.c.）治疗6周后，空腹血糖水平显著降低（*p<0.05，***p<0.001；与对照组比较）（n=8/组）。

用0.5 mg/kg BPI-3016（s.c.）治疗4周后，与对照组（n=8/组）有相似的效果（*p<0.01）。

b）BPI-3016对糖化血红蛋白水平的影响。

慢性注射0.5 mg/kg BPI-3016治疗8周后，糖化血红蛋白显著降低（*p<0.05，与对照组比较）（n=8/组）。

数据表示为平均值±SEM。

3.3。

长期治疗BPI-3016可改善INDB/DB小鼠的血糖控制
为了观察bpi-3016对db/db小鼠血糖控制的慢性作用，比较了空腹血糖和HbA1c在溶媒对照、低剂量bpi-3016（0.2 mg/kg）、高剂量bpi-3016（0.5 mg/kg）和nn9535（0.2 mg/kg）组的水平。

结果表明，与媒剂对照组相比，0.2 mg/kg BPI-3016（16.81 mm对11.86 mm，p<0.05）连续6周给药后降低了db/db小鼠的空腹血糖水平（图3a，表S6）。

大剂量BPI-3016对大剂量组空腹血糖的降低作用更为显著：给药4周后空腹血糖水平显著降低（11.91 mmvs.9.43 mm；p<0.01），6周用药后维持减量（16.81 mm对7.90 mm；p<0.001）。

同样，我们发现NN9535能显著降低空腹血糖水平，如图3b所示，高剂量BPI-3016组（7.26%对6.26%；p<0.05）和NN9535组（p<0.01）的糖化血红蛋白水平在治疗8周后显著降低，提示BPI-3016在血糖控制方面具有显著的抑制作用。

图4
图4。

单次给药BPI-3016对自发性糖尿病猴血糖的影响：给药后2、8 h测定餐后血糖水平，0、22、46、94、118、142、166 h测定空腹血糖水平。

给药后各时间点血浆葡萄糖变化的百分比在第一次给药前用单个空腹血糖水平计算。

同时计算各组餐后和空腹血糖与基线变化的平均百分比。

a）餐后和空腹血糖水平。

单次皮下注射0.4mg/kgbpi-3016，与糖尿病对照组相比，给药后46 h空腹血糖水平显著降低（**p<0.01），单因素方差分析，LSD-T检验（n=6-10/组）。

b）餐后和空腹血糖变化与基线的平均百分比。

单次皮下注射0.2，0.4mg/kgbpi-3016，与糖尿病对照组相比，在166h内降低了平均血糖变化率（**p<0.001）；采用单因素方差分析，随后进行LSD-T检验（n=6-10/组）。

数值显示为平均值±SEM。

3.4.单次给药BPI-3016对自发性糖尿病食蟹猴的血糖低影响
研究了BPI-3016在自发性糖尿病食蟹猴体内的药动学特性。

BPI-3016在糖尿病食蟹猴模
型中的半衰期为95小时（表3）。

在单次给药BPI-3016或艾塞那肽前以及给药后2、8、22、46、94、118、142和166 h监测餐后和空腹血糖（图4a）。

为了排除猴子之间的个体差异，计算每只自发性糖尿病食蟹猴（图4b）的个体基线血糖水平的平均葡萄糖变化百分比。

结果表明，单次皮下注射0.4mg/kg BPI-3016可显著降低空腹血糖水平。

给药后46 h水平（P<0.01）。

此外，0.2和0.4 mg/kg BPI-3016组的平均血糖变化率（变化率分别为-27%、-28%和0%，P<0.001），与基线相比，166 h以上的平均血糖变化率显著降低，而艾塞那肽组的平均血糖变化率则显著降低。

总之，0.2和0.4mg/kg BPI-3016治疗具有明显的降血糖作用，其降糖效果优于艾塞那肽。

3.5。

慢性治疗BPI-3016可减轻自发性糖尿病食蟹猴的糖尿病症状
为了评价BPI-3016的慢性作用，在糖尿病患者中测定空腹血糖水平、糖化血红蛋白水平和糖耐量。

对照组、BPI-3016组（0.1、0.2、0.4 mg/kg）、艾塞那肽组和正常对照组。

结果表明，与糖尿病对照组相比，正常肥胖对照组的快速血糖水平稳定在较低水平，两组之间的快速血糖水平差异随时间逐渐扩大。

随着服药次数的增加，BPI-3016每周注射一次，尤其是剂量分别为0.2 mg/kg和0.4 mg/kg的降糖作用得到了长期的延长（图S3）。

进一步计算了6周期间基线时空腹血糖变化的平均百分比（图5a）。

结果表明，低、中、高剂量BPI-3016组空腹血糖变化的平均年龄分别为−3%、−19%和−20%，中、高剂量BPI-3016组（P<0.001）与糖尿病对照组（9%）有统计学显著差异，反映了有效的降血糖作用。

低剂量BPI-3016（−3%）和艾塞那肽组在空腹血糖水平变化的平均百分比方面没有统计学差异。

上述结果表明，每周服用一次BPI-3016 66次，对降低糖尿病患者的空腹血糖水平具有长期剂量依赖性。

Betic肥胖猴子和0.2、0.4mg/kg的BPI-3016比艾塞那肽表现出更显著的葡萄糖调节作用，分析治疗前后糖化血红蛋白水平的变化，以证明BPI-3016在降低糖化血红蛋白水平方面的作用（图5b）。

结果表明，大剂量BPI-3016组在6次每周给药后，糖化血红蛋白水平较糖尿病对照组显著降低（分别为-0.62%和1.05%，P<0.001）。

中剂量BPI-3016组（0.20%）和艾塞那肽组（0.29%）（P<0.05）的糖化血红蛋白水平略有升高，在第7次给药（图S3）后的第1天和第7天给药（图S3）前对猴子进行了两次IVGTT试验，以评估葡萄糖醇的变化，用Kglucose表示。

每周7次用药后，与糖尿病对照组相比，大剂量BPI-3016组的变化百分比显著增加（27.6%对-18.2%，p<0.01）。

0.2 mg/kg的BPI-3016（17.4%）和艾塞那肽治疗组（11.0%）的Kg-葡萄糖变化也显著增加（P<0.05）（图5C）。

由于在IVGTT试验中外源性葡萄糖负荷导致胰岛素分泌，因此比较了胰岛素分泌增量率（胰岛素水平与基线水。