BPI-3016,一种新型长效hglp-1类似物,用于治疗2

BPI-3016，一种新型长效hglp-1类似物，用于治疗2型糖尿病

内容简介

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物常用作为治疗2型糖尿病（t2dm）患者的附加药物。目前，研发每周注射一次，具备自由度和灵活性的长效GLP-1类似物已成为主流。在这里，我们通过对人体GLP-1进行结构性修饰，成功地研发了一个半衰期显著延长，抗二肽基肽酶IV（DPP-IV）裂解的长效人类GLP-1（7–37）类似物（BPI-3016）。含GLP-1受体亲和力的BPI-3016体外活性研究并测定了环磷酸腺苷（cAMP）产生的刺激性。为了了解BPI-3016的体内活性及其对血糖控制的影响，我们测量了ob/ob小鼠、db／db小鼠和和自发性糖尿病食蟹猴的β细胞质量和体重。结果表明，结果表明，BPI-3016对GLP受体具有良好的亲和力。并且能够刺激环磷酸腺苷（cAMP）的产生。在体内药动学研究中，在对糖尿病食蟹猴单次给药后，BPI-3016的半衰期长达95小时以上。此外，BPI-3016单次给药后一周时间内减少了禁食和餐后血糖水平。在7周中，每周注射一次次后，它降低了体重指数（bmi），体脂，提高了提高葡萄糖耐受性并表现出胰岛素缺乏效应。总之，BPI-3016保留了GLP-1的作用，显著延长了半衰期，在临床上，是每周注射一次治疗2型糖尿病的一种有希望的方法。

介绍

在2型糖尿病高血糖的进展中，β细胞功能障碍和抗胰岛素是主要的病理事件。多种治疗剂，比如一些以恢复β细胞功能为目标的口服药或外源性胰岛素（主要是通过减少β细胞负荷或诱导β细胞休息）在最近几十年有了很大进展。然而，很多传统的治疗2型糖尿病的方法不能显著改善β细胞功能，同时可能带来一些副作用，比如体重增加，低血糖风险和周围高胰岛素血症增加。因此，最近很多研究致力于显著改善β细胞功能，同时避免相关副作用。肠促胰岛素药物GLP-1类似物通过抑制胰高血糖素分泌增加胰岛素分泌来降低血糖水平，成为治疗2型糖尿病高的理想药物，因为它们通常可耐受，副作用小。这种药物可以通过减缓胃排空，降低食欲来降低体重，并且可显著减少低血糖风险。

GLP-1在小肠和结肠远端的肠内分泌细胞中产生。在食品摄入后，它的血浆水平迅速上升，通过促进与葡萄糖浓度相关的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，降低循环葡萄糖。具有生物活性的GLP-1来自于以两种以等势循环分子形式GLP-1（7–37）和GLP-1（7–36）酰胺的GLP-1（1–37）。其中GLP-1（7–36）酰胺代表GLP-1在人体血浆中的大部分循环活动。由于二肽基肽酶和中性内肽酶作用，血液中原有的GLP-1会快速的降解，半衰期非常短。因此，设计一种与人体原有GLP-1具有相同生物活性，但同时具有很强的抗酶分解能力的GLP-1类似物是一种具有前景的研发方向。目前FDA批准的两种GLP-1类似物包括两个一天一次或两次注射的药物（艾塞那肽和利拉鲁肽）以及三个一周注射一次的药物（阿比鲁肽，杜拉鲁肽和长效缓释艾塞那肽注射液），这种一周内在一天任何时候注射的药物，可以避免在口服制剂中常见的食物-药物相互作用，可以减少注射次数，并有可能提高患者的依从性。为了提升GLP-1类似物的安全性和药效，人们投入大量精力研发一周注射一次的药物。

GLP-1（7–37）和GLP-1（7–36）氨基末端Ala8的酰胺键（-NHCO-）对二肽基肽酶的分裂非常敏感。理论上说，对GLP-1氨基末端的修饰可以带来对二肽基肽酶的抑制作用的抵抗，因此能够延长半衰期，提高药效。在我们之前的研究报导中，通过用一种含有-CF3-的连接单元结构性地替换GLP-1（7–36）氨基末端Ala8的酰胺键（-NHCO-），我们构建了一种新的GLP-1（7–36）类似物BPI-3006。同样地，通过结构性地替换氨基末端和34号位置的氨基酸（赖氨酸到精氨酸），并用对26号位置的带有C-18脂肪酸链的赖氨酸进行酰化反应，我们发明了一种GLP-1（7–37）类似物BPI-3016。长脂肪酸转化为肽的共轭克服了二肽基肽酶的降解作用，通过促进与血浆蛋白的结合防止天然GLP-1肾滤过，如白蛋白，减少肾脏的排泄。

显著延长的天然GLP-1半衰期使2型糖尿病人一周注射一次成为可能。在这个研究中，我们通过评估其对GLP-1受体的亲和力，刺激环腺苷酸的生成能力，和对二肽基肽酶降解的抵抗能力，评估了BPI-3016的体外生物活性。此外，我们还描述了BPI-3016在三种典型糖尿病动物（ob/ob、db/db小鼠和自发性糖尿病食蟹猴）在血糖水平，胰岛素分泌，体重，葡萄糖耐量，胰腺β细胞功能方面的体内活性。

2.原料和工艺

肽类

贝达药业通过净化和表征，人工合成GLP-1、BPI-3016和NN9535（BPI-3016的肽序列见表S1），GLP-1受体结合实验由上海的辉源生物完成。体外研究所用的GLP-1类似物利拉鲁肽由贝达药业提供，用于动物试验的利拉鲁肽（维克托萨）和注射用艾塞那肽微球（百达扬）分别从诺华和阿斯利康购买。在所有的试验中，BPI-3016溶于0.01 M磷酸氢二钠缓冲液（ph=8～9）。在活体研究中，用生理盐水或0.01 M磷酸氢二钠缓冲液（ph=7.96）稀释BPI-3016。

2.2。细胞培养和细胞传染

在37℃下100 g/ml链霉素，5%（v/v）CO2加湿环境中，HEK293细胞（ATCC）在DMEM （杜尔贝科改良伊格尔培养基），10%（v/v）胎牛血清，100单位/ml青霉素中培养。

为了把人体GLP-1传染给HEK293细胞，在细胞以大约70%的融合度播种后，根据制造商的协议，使用了脂质体胺M2000制剂。

2.3。活性配体结合法测定GLP-1受体的结合亲和力

采用竞争性放射性配体结合分析法，获得BPI-3016抑制常数Ki，反映GLP-1受体结合亲和力的参数。感染了GLP-1受体的HEK293细胞在10 s于15 ml冰结合缓冲液（50 mM羟乙基哌嗪乙磺酸，10 mM氯化镁，100 mM 氯化钠）中均匀混合。细胞匀浆在18000g下离心20分钟。将含有沉淀剂的细胞膜用1毫升冰凝缓冲液重新悬浮。肽储备溶液（1 mM）被含0.1%牛血清白蛋白（ph=7.4）连续结合缓冲液稀释。15升肽溶液（（300 pm–10 m，10倍），15升125I-GLP-1（2.5纳米，10倍）（珀金埃尔默制造）以及120L细胞膜匀浆室温下在96孔板中培养1小时。此外，通过用125I-GLP-1和细胞膜匀浆在96孔板中进行全结合或非特异性结合控制，培养15 L结合缓冲液或GLP-1（1 M）。在培养完成后，反应混合物被倒入进入96孔滤板（珀金埃尔默制造）中，通过细胞收割机（过滤材料通用收割机，珀金埃尔默制造）进行过滤。用羟乙基哌秦乙硫磺酸缓冲液洗涤3次，夜间温度保持37度去湿。放射性（每分钟校正计数，ccpm）通过用微型板闪烁计数器（1450微珠Trilux，珀金埃尔默制造）对每孔进行分析。根据Tobelow公式计算125I-glp-1的抑制性受体结合率：

抑制结合率（%）=（CCPM化合物−CCPM非特异性对照）×100/（CCPM总结合对照−CCPM 非特异性对照）。

利用图垫棱镜5.0对数据进行分析，用IC50计算Ki值。