HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总

HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总

一、反相高效液相色谱法测定鼠胆汁中游离与结合型胆汁酸

(一)试验仪器

Ardent LC-1100高效液相色谱仪，附荧光检测器(A gilent公司，美国);Waters Nova C18色谱柱( 3.9 X 150 mm, 5l.μm) ( Waters公司美国)，保护柱及C18柱芯(Phenomenmex公司美国)；Chromabond C18固相萃取小柱(M acherey- Nagel)公司德国)。

(二)试验试剂

4-嗅甲基-7-甲氧香豆素(BM C)、18-冠醚-6(DCC)，α-鼠胆酸(α-MCA) ,β-鼠胆酸(β-M CA)、熊脱氧胆酸(U DCA)、胆酸(CA)、猪脱氧胆酸(H DCA )、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸

(GCDCA)标准品及胆酞甘氨酸水解酶均购自美国sig m a公司。甲醇、乙睛(色谱纯，美国天地公司)，月桂酸(分析纯，上海化学试剂公司)，氢氧化钾、磷酸二氢钾(分析纯，成都化学试剂厂).

(三)色谱条件

流动相:A相，甲醇:乙睛为1:2(V/V)；B相，超纯水；梯度洗脱程序:65%A (0~8min)，80% A(8~16 min)，90% A(16~20 min)；柱温：20℃；流速:1 mL/ min;

激发波长:330nm；发射波长：400nm。

(四)样品处理

样品预处理:取鼠胆汁20μL，加入120μmol/ L月桂酸甲醇液50μL，再加入乙睛2 mL，充分混匀，超声20 min, 10 000 g离心10 min，取上清液，在60℃氮气下吹干。

胆汁酸的提取:测定游离与甘氨结合型胆汁酸时，将预处理吹干后的胆汁样品溶于2 mL 0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7)，加至已活化的固相萃取

C18小柱上(用2 mL甲醇和5 mL蒸馏水依次活化C18小柱)，再用10 mL蒸馏水淋洗小柱，最后用3mL甲醇洗脱胆汁酸.测定牛磺结合型胆汁酸时，向预处理吹干后的胆汁样品中加入1 mg胆酞甘氨酸水解酶，再加入0. 025 mol/ L的磷酸钾缓冲液(pH 5.6) 0.5 mL,避光37℃反应30 min，再加入O.5 mol/ L 磷酸盐缓冲液(pH 7) 2 mL终止反应.然后加至已活化的固相萃取C18小柱上，其余步骤同测定游离与甘氨结合型胆汁酸.

胆汁酸的衍生与测定:向胆汁酸洗脱液中加入150 μL 1. 8 mmol/ L KOH 甲醇液于60 ℃氮气下吹干，然后加入10 mmol/ L BM C乙睛液与5 mmol/ L DCC乙睛液各50μL，密闭，37℃条件下反应30min，取10μL进样分析. 二、高效液相色谱滓联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆酸

(一)试验仪器

AP I 2000质谱仪(加拿大A pplied Biosystens公司)，配备Perk in E Inmer 200泵和tubro离子源;A tlantisdC18色谱柱，150 mm X 3.9 mm, 5μm(美国Waters公司)，保护柱及C18柱芯(美国Phenan enex公司)，Chrcm abond C18 ec ( 3 mL /200 m g德国M achere-N agel公司)，M illpore纯水装

置(美国M illpore公司)。15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯(Sigma 公司);甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司)。

(二)试验试剂

15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯(Sigma公司);甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司)。

(三)色谱条件

柱温:25℃；流速:1 m L /min分流比为1:4；流动相A: 5 mm o 1/L醋酸铵和0.O1%甲酸水溶液；B: 5 mm o 1/L醋酸铵和0 O1%甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序为:Omin（80% B)→9min(97.0% B) →10 m in ( 80% B) →15 m in ( 80 % B )。

(四)样品处理

蛋白沉淀法：800 μL乙睛中加入300 μL血清，混匀1 min,超声30min以15000 X g离心15min,取900μL上清液60℃氮气吹干，其余同固相萃取。

固相萃取法：依次用1 mL甲醇,1mL0.05%甲酸溶液活化固相萃取小柱。1 mL 0.05%甲酸溶液中加入300μL血清，混匀1 min后上小柱。依次用1 m L 0.05%甲酸溶液、1 mL甲醇水溶液( 45: 55, V /V)冲洗。在重力作用下滴干后，真空抽干。再用L 5 mL甲醇洗脱，洗脱液在600C氮气吹干，残余物溶于100 μL流动相(A: B= 20: 80，V/V)中，漩涡混匀lmin超声2min。

取20 μL进行H PLC-MSIMS分析，检测时间15min。

三、高效液相色谱法同时测定胆汁中9种结合型胆汁酸

(一)试验仪器

Shimadzu 2010LC- AHT高效液相色谱仪，附紫外检测器(日本Shimadzu

公司);Aglient固相萃取装置(美国Aglient公司);Millipore纯水装置(美国

Millipore公司)；Chromabond C18固相萃取小柱(德国Maeherey- Nagel

公司)；牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholic acid TUDCA)、牛磺胆

酸(CTaurocholic acid TCA)、甘氨胆酸(Glycocholic acid,GCA)、甘氨石

胆酸(Glycol-ithochdic acid, GLCA)、甘氨脱氧胆酸(Glycodeoxycholic

acid,GDCA)牛磺脱氧胆酸(CTaurodeoxycholic acid TDCA)、甘氨鹅脱氧

胆酸(Glycochenodeoxycholic acid GCDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸门，

aurochenodeoxycholic acid, TCDCA)、牛磺石胆酸CTaurolithocholic acid

TLCA)标准品均购自美国sigma公司;甲醇、乙睛(色谱纯，美国Tedia

公司)，其余试剂均为分析纯。

(二)试验试剂

牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholic acid TUDCA)、牛磺胆酸

(CTaurocholic acid TCA)、甘氨胆酸(Glycocholic acid,GCA)、甘氨石胆

酸(Glycol-ithochdic acid, GLCA)、甘氨脱氧胆酸(Glycodeoxycholic

acid,GDCA)牛磺脱氧胆酸(CTaurodeoxycholic acid TDCA)、甘氨鹅脱氧

胆酸(Glycochenodeoxycholic acid GCDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸门，

aurochenodeoxycholic acid, TCDCA)、牛磺石胆酸CTaurolithocholic acid

TLCA)标准品均购自美国sigma公司;甲醇、乙睛(色谱纯，美国Tedia

公司)，其余试剂均为分析纯。