【学习课件】第六章动物繁殖技术

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四、卵子和胚胎的冷冻保存的方法
（一）抗冻剂的种类
1. 低分子渗透型冷冻保护剂
甘油（GL）、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇 （PG）、乙二醇（EG）、1，3丁二醇（BG）、 甲基溶纤剂（MC）、乙酰胺（AC）、聚乙二醇 （PEG）等。
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四、卵子和胚胎的冷冻保存的方法
（一）抗冻剂的种类
冷冻可引起卵母细胞ZP收缩，破坏细胞骨架，损 伤细胞膜和细胞内部结构的完整性，还能损伤细胞 整体，阻碍极体产生，增加DNA不稳定性而导致染 色体异常。
为避免此类现象的发生，一般于-7℃时采用植冰法 及时启动脱水过程，从而在较高的温度下诱导形成 结晶，逐渐扩散至整个溶液，避免冰晶突然形成。
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抗冻物质一般为小分子物质，在0℃以上很容易通 过细胞膜进入细胞质。加入保护剂后，细胞内部冰 晶形成温度显著降低。此外，保护剂与水分子结合 形成氢键，从而降低冻结部分电解质浓度，减少对 细胞的损伤。
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2. 非渗透型冷冻保护剂
（1）小分子物质 单糖（如葡萄糖），双糖（如蔗 糖、海藻糖），三糖（如棉子糖）和其它糖类。
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三、卵子和胚胎冷冻保存的原理
胚胎和卵子在冷冻和解冻过程中两次通过冰晶形 成危险区（-15℃～-50℃），采取适当冷冻方法 和低温保护剂，使其安全通过危险温区。
进行冷冻处理前，向保存液中加入保护剂（如甘 油），改变细胞膜渗透性和溶液渗透压，防止溶 液效应和渗透压差异，减少降温和复温过程冰晶 的形成。
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三、卵子和胚胎冷冻保存的原理
一般卵子或胚胎在冷冻过程中不可避免要形 成细胞内冰晶，但只要不形成大冰晶，而是 维持微晶（冰核）状态，细胞将不受伤害。
胚胎在冷冻过程中，大约在-10℃以上细胞内 不结冰，而在-10℃以下时，过冷胞质就形成 冰晶。
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三、卵子和胚胎冷冻保存的原理
第六章 卵子和胚胎的冷冻保存技术
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一、卵子和胚胎冷冻保存的意义
（一）定义 采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎
或卵母细胞在-196℃下停止代谢，而升温后 又不失去代谢能力的一种长期保存胚胎和卵 母细胞的技术。
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（二）卵子和胚胎冷冻保存的意义
冻胚移植还有鲜胚移植所不可比拟的优越性。
所谓玻璃化是指利用物理学原理，将高浓度的冷 冻保护剂急速降温后，使其由液态转化为外形似 玻璃状的稳定且透明的非晶体化固态，但并没有 改变其在液态时的分子和离子分布。玻璃化可避 免在细胞内形成冰晶而对细胞产生伤害。
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二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况
冷冻和解冻处理尽管对胚胎有一定的损伤，但将 解冻胚胎在体外培养一段时间后可恢复正常的形 态。目前，牛冷冻胚胎移植后的妊娠率与鲜胚移 植的妊娠率相似。
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三、卵子和胚胎冷冻保存的原理
常规冷冻保存胚胎是在胚胎脱水前诱导结晶，然 后缓慢降温脱水，解冻时快速复温到常温。
玻璃化法使用的玻璃化液是一种粘稠的玻璃态物 质，低温时不结晶就可固化。胚胎在此溶液中脱 水到一定程度，可引起内源性大分子和已渗入的 保护剂浓缩，从而使细胞在急剧降温过程中得以 保护。
卵母细胞体积大，不易充分脱水，故冷冻不易成 功。
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二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况
Whittingham（1977）首次成功地冷冻保 存小鼠卵母细胞以来，人们在此方面进 行了大量的研究。玻璃化法冷冻的小鼠 成熟卵母细胞体外受精及胚胎移植后产 仔率已达20%～38%。
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二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况
1972年，Whittingham等首次实现了小鼠胚胎 的超低温冷冻保存，冻胚解冻后移植，产出正常 后代。这种方法已广泛应用于牛、绵羊、山羊、 马、家兔、猪等其它哺乳动物的胚胎超低温保存。
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二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况
1985年， Rall和Fahy率先将玻璃化冷冻技术应用 于鼠胚胎的冷冻保存。
（2）高分子物质 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、白蛋 白、左旋糖苷、聚乙烯醇（PVA）、羟乙基淀粉 和蛋黄等。
主要通过改变渗透压，引起细胞脱水，从而发挥 非特异性保护作用，又称为细胞外冷冻保护剂。
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不论是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要 是为了给细胞造成脱水状态，但脱水的同时不能影响 到细胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对细胞造成 的损害也是冷冻应注意的方面之一。
目前已有关于人、小鼠、牛等卵母细胞冷 冻成功的报道，但其成功率较低。
于永存等（2002）报道，用玻璃化法冷冻
保存牛GV期卵母细胞，解冻后其体外成熟
率、体外受精率和卵裂率分别为21.6%、
15.1%和11.1%，显著高于程序冷冻法和超
快速冷冻法的效果。
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三、卵子和胚胎冷冻保存的原理
当生物细胞在水溶液中冷却时，细胞和培养液均先处于过冷 状态，然后才发生冻结。在大多数情况下，细胞的过冷程度比 周围溶液更深，细胞外溶液先结冰，使溶质浓缩，导致细胞外 环境渗透压升高。若降温足够慢，可通过脱水来维持细胞内外 环境渗透压平衡；但是降温过慢，细胞长时间处于高渗环境中 易产生渗透休克；若降温过快，细胞内水分来不及移到细胞外 而形成冰晶。胞浆内结冰过多会破坏细胞器，刺破细胞膜，导 致细胞死亡。通过冻前在稀释液中加入一定浓度的低温保护剂， 让细胞在保护剂中平衡并适当脱水，可降低其损伤。
业已证实，单纯就低温保存而言，影响细胞冷冻保存 的关键因素，是细胞冷冻和复温过程中，必须两次经 过冰晶形成和重结晶的中间损伤温度区。在冷冻过程 中，如果含水量过多，细胞可能毁于过度冰晶形成。 但脱水过度，细胞也可能死亡。
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➢1. 建立优良品种的胚胎库或基因库，保存动物品 种、品系和稀有突变体；
➢2. 运输胚胎代替活畜的运输，节省运输费用和检 疫费用，减少疾病传播；
➢3. 控制品种内的遗传稳定性和维持某些近交系动 物的遗传一致性，节省大量时间和资金；
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二、卵子和胚胎冷冻保存的研究概况
1952年，Smith报道用甘油作保护剂，对兔的 受精卵进行慢速冷冻。但当时无法判定该技术是 否成熟。