聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸

生物化学实验报告

题目：聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl 法

姓名：余振洋 学号：200900140156 系年级：09级生科3班

同组者：张刚刚 时间：2011/4/16

一．【实验目的】

1.了解并掌握DNS-氨基酸制备和鉴定的原理及方法。

2.掌握聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸的操作和方法。 二．【实验原理】

荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（5-dimethylamino-1-naphthylene

sulfonyl chloride ，Dansyl ch1oride ，简称DNS-Cl ）在弱碱性（pH9.0 左右）条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成带黄色荧光的 DNS- 氨基酸。

DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法分离，所得层析图与DNS-标准氨基酸层析图谱相对比，可借此鉴定样品中氨基酸的种类，用此法鉴定蛋白质N-末端氨基酸比FDNB 法灵敏100倍，仅 10-10～10-9mo1样品即可检出，产物也比DNP-氨基酸稳定，且操作简便、快速。

DNS-Cl 在pH 值过高时，会水解产生副产物DNS-OH ，反应时如下：

9 PH 9.9 37℃，1h

DNS —Cl 氨基酸

DNS —氨基酸

在DNS-Cl过量时，又会产生DNS-NH2，反应式如下：

在紫外光照射下，DNS-OH 和DNS-NH2 产生蓝色荧光，而 DNS- 氨基酸产生黄色荧光，可彼此区分开。

三．【实验材料】

1.器材：

小离心管

紫外灯（波长254nm或265nm）。

37℃恒温水浴。

电吹风。

层析缸（10cm×20cm）。

毛细管（点样管）。

聚酰胺薄膜。

容量瓶（100ml）。

移液管（2ml）。

培养皿,移液枪,移液管。

2.试剂：

①DNS—Cl丙酮溶液：称取25mg DNS—Cl溶在10ml丙酮中。

②展层液：甲酸∶水=1.5:100（V/V）。

③氨基酸样品：标准丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及混合氨基酸液。

四．【实验步骤】

1.DNS-氨基酸的制备

取4只离心管，分别加入标准丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及混合氨基酸30μl，再各加入DNS—Cl丙酮溶液30μl，混匀后放入37℃恒温水浴中保存1h。

2.点样

取聚酰胺薄膜一张，在距离一端1cm处用铅笔画一直线，在直线上取间距

1cm的四点，作为点样原点。用毛细管取上步制得的DNS-氨基酸液进行点样，点样直径不超过2mm，重复2—3次，每次点样后用冷风吹干再点下一次，吹干。

3.展层

将上述聚酰胺薄膜光面向外卷曲（两边不接触）外扎以牛皮筋，直立于盛有展层液12-13ml的培养皿盖或10ml的培养皿底中，盖上500ml 烧杯。当展层剂上升到距离顶端大约0.5cm时结束，取出，冷风吹干。

4.结果观察

将聚酰胺薄膜置于紫外灯下，观察荧光斑点，区分DNS-氨基酸，DNS-NH2

与DNS-OH，用铅笔在黄绿色斑点边缘轻轻画图做记号，将样品图谱与标准图谱对比找出各种氨基酸相应的位置。

五．【注意事项】

1.在DNS-氨基酸制备时，DNS化必须在碱性条件下（pH9.0左右）进行，否则会有很多副产物DNS—NH2或DNS—OH产生。

2.点样点要小、圆、量要适当，否则拖尾，因此毛细管要细，头要平，点上后立即拿开，样品浓度要合适，聚酰胺薄膜要选择优质的。点样直径不宜超过2mm，点样后立即吹干，同时点样力度不宜过大，防止把薄膜穿透而影响最终结果。

3.点样点间距不能太小，以免相互干扰；点样点距薄膜边缘不能太近，否则会产生边缘效应。

4.每次点样后，立即吹干，才可进行下一次点样，否则液体扩散，点样面积过大，影响展层效果。

5.展层剂液液面要低于点样点，但也不能太低。

6.紫外光对人体有害，因此要尽量缩短在紫外灯下的观察时间，注意不要把头伸到灯下观察。

六．【实验结果】

1.绘图

图一 DNS 氨基酸聚酰胺薄膜层析结果（1. DNS-Ala 2.DNS-Phe 3.DNS-Lys

4.DNS-双-Lys ）

4

1

2 2

3 3 1

4

2.R f 值的计算：

R f =

注：上式中x 代表色斑中心至原点中心的距离，Y 代表展层剂前缘至原点中心的距离。其中，Y 值经测量，统一为5.7cm 。

在混合氨基酸中：

1. 对于丙氨酸：X1=3.50cm ， 则Rf1 =0.61

2. 对于苯丙氨酸：X2 =1.50cm ，则Rf3 =0.26

3. 对于赖氨酸：X3 =0.90cm ，则Rf3 =0.16

X4 =4.50cm ，则Rf4 =0.79

各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf 值相同。 七．【结果分析及讨论】

从上述实验结果可以分析出：混合氨基酸中同时含有赖氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸三种氨基酸。

同时可以看到，薄膜上代表同一氨基酸的荧光点的位置并不完全在同一水平线上，而相互有错落，造成这种现象的原因可能有：

1. 点样时用力过大，导致聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导致心形黄绿色荧光斑出现。

2. 点样时不及时吹干，致使点样液扩散，会在很大程度上影响实验结果，所以要严格控制点样点的大小，最好不要超过2mm ；同时点样时应重复2-3次，防止点样液成分不足或者没有点上。

3. 点样时若两点之间间隔过小，使得点样点之间相互影响，从而影响了最终实验结果，本次实验宜控制在1cm 左右。

4．展层剂液面高于点样点，使得DNS-氨基酸部分溶解在了展层液里，影响了最终结果。

5．用铅笔画起始的横线时，力度过大，形成了一条凹槽，对于层析会有不同程度的阻碍作用。

图中，赖氨酸有两个黄绿色荧光斑点，说明它和DNS-Cl 反应有两种产物。这是因为： Lys 含有两个氨基，因此Lys 带有两个黄绿色荧光标记。又由于DNS-Cl 主要与α-氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光的是Lys 的δ-氨基反应后的DNS-Lys 。

查阅资料得到以下几条结论： 1. DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在最上方；而Lys 由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe 的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。 2. 聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。导致所展示的层析

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