大豆分离蛋白溶解性能与水解度相关的研究

12 7 70 2 1 500 8 3. 50 ±0. 05 80. 07 ±0. 27
13 9 40 4 3 000 8 4. 82 ±0. 07 84. 13 ±0. 28
14 9 50 3 1 500 9 4. 71 ±0. 07 83. 92 ±0. 28
15 9 60 2 6 000 6 5. 60 ±0. 08 86. 82 ±0. 26
4 3 70 4 6 000 9 4. 76 ±0. 07 84. 03 ±0. 28
5 5 40 2 4 500 9 6. 54 ±0. 09 89. 04 ±0. 36
6 5 50 1 6 000 8 4. 74 ±0. 07 83. 98 ±0. 28
7 5 60 4 1 500 7 5. 04 ±0. 08 85. 09 ±0. 29
米曲霉 木瓜
应用 pH 7～10 6～8 6～8 5～7
应用温度/ ℃ 40～70 40～60 45～60 60～75
图 1 四种蛋白酶水解 SPI 后的 DH 和溶解度
从图 1 可以看出 ,在同等水解条件下 ,Alcalase 水 解物溶解性和 DH 都要优于其他三种蛋白酶 。因此 选用 Alcalase 为 SPI 的最适水解用酶 ,对其改性后溶 解性的变化进行研究 。
H722 可见分光光度计 :天津市普瑞斯仪器有限 公司 ; HYP - Ⅱ型消化炉 、凯氏定氮仪 :上海纤检仪器 有限公司 ;B∆CHI B - 290 型喷雾干燥仪 :瑞士步琪公 司 ;LD4 - 2A 离心机 :北京医用离心机厂 。 1. 3 试验方法 1. 3. 1 蛋白酶活力的测定
蛋白酶活力测定采用福林酚法 (QB/ T 1803 — 1993) 。
酶活力单位 :在特定的试验条件下 ,每分钟水解 酪蛋白产生 1μg 酪氨酸的酶量为一个酶活单位 。
酶活力 (单位数/ g 酶制剂) = 4/ 10 ×K ×OD ×n 式中 :4 为反应混合物总体积 4 mL ;10 为酶反应 时间 ; K为标准曲线中 OD 值为 1 时相当的酪氨酸微 克数 ;n 为酶的稀释倍数 。 酶活标准曲线为 y = 0. 009 5 x - 0. 002 9 ,由直线 的斜率计算 K值为 105. 568 。 1. 3. 2 酶水解单元操作 按一定的底物浓度准确称取大豆分离蛋白 ,加
活力 5. 0 ×104 U/ g) :NOVO 公司 ;中性蛋白酶 (酶活力 6. 0 ×104 U/ g) :北京奥博星生物技术有限责任公司 ; 木瓜蛋白酶 (酶活力 5. 0 ×104 U/ g) :无锡杰能科生物 工程有限公司 ;大豆分离蛋白 :哈高科大豆食品有限 公司 ;其他试剂均为分析纯 。 1. 2 仪器设备
收稿日期 :2008 - 07 - 16 作者简介 :李秀川 ,男 ,1983 年出生 ,硕士 ,食品科学 通讯作者 :迟玉杰 ,女 ,1963 年出生 ,教授 ,博士生导师 ,食品科学
1 材料和方法
1. 1 材料与试剂 Alcalase (酶活力 2. 0 ×105 U/ g) 、Flavourzyme ( 酶
2009 年 7 月 第 24 卷第 7 期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol . 24 ,No. 7 J ul . 2009
大豆分离蛋白溶解性能与水解度相关的研究
李秀川 迟玉杰
(东北农业大学食品学院 ,哈尔滨 150030)
溶解 度 = ( 可 溶 性 蛋 白 质 含 量/ 总 氮 含 量) ×
100 % 1. 3. 5 蛋白质含量的测定
蛋白质含量测定采用凯氏定氮法 ( GB5009. 5 — 2003) 。
2 结果与讨论
2. 1 水解用酶对 SPI 溶解性能的影响 不同蛋白酶对蛋白质的作用位点不同 ,因此不
同水解酶对 SPI 的水解作用也不同 。选用 Alcalase 、 Flavourzyme 、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶四种工业常用
现有大豆蛋白质来源丰富且价格低廉 ,采用酶 法对 SPI 进行有限水解 ,不但提高了其溶解性 ,也不 会减弱其营养价值 ,从而大大拓宽了大豆蛋白在食 品和饮料中的应用范围 ,并可获得较高经济效益 。
基金项目 :国家“863”项目 (2006AA10Z322) ,哈尔滨市“十一五”重 点科技攻关 ( GJ2007 GG020088)
序
酶用量
浓度 号
/℃
/h
pH / U/ g
DH
/%
溶解度 /%
1 3 40 1 1 500 6 2. 63 ±0. 04 75. 44 ±0. 26
2 3 50 2 3 000 7 6. 00 ±0. 09 87. 26 ±0. 27
3 3 60 3 4 5 00 8 8. 27 ±0. 12 92. 72 ±0. 32
摘 要 为了提高大豆分离蛋白的溶解性 ,利用 Alcalase 碱性蛋白酶 ,通过正交试验对大豆分离蛋白进行 限制性水解 ,研究水解度对大豆分离蛋白溶解性的影响 。结果表明 :大豆水解蛋白在低水解度范围内 (1. 26 % ～7. 93 %) ,溶解性随水解度的增加呈指数增加 。在最佳工艺条件下 ,温度 60 ℃,pH 8. 0 ,底物浓度 9 % ,酶添 加量 4500 U/ g ,水解时间 3 h ,水解度可达为 7. 93 % ,溶解度达 92. 17 %。并且大豆水解蛋白的溶解性受 pH 和 离子强度等因素的影响 ,且影响程度随水解度的增加而减小 。
4. 84
5. 84
均值 4
4. 80
4. 04
极差
0. 62
1. 80
时间 (C) /h
酶用量 (D) / U/ g
pH( E)
4. 02
3. 97 4. 51
5. 41
4. 82 5. 09
5. 52
6. 21 5. 28
5. 15
5. 09 5. 16
1. 50
2. 24 0. 77
反应初期水解速度较快 ,容易出现偏差 。b 值应与反 应初 DH 有关 ,属于溶解度的校正值 。
16 9 70 1 4 500 7 4. 06 ±0. 06 81. 77 ±0. 30
第 24 卷第 7 期
李秀川等 大豆分离蛋白溶解性能与水解度相关的研究
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表 4 DH 极差分析结果表
序号
底物浓度 (A) 温度 (B)
/%
/℃
均值 1
5. 42
4. 82
均值 2
5. 04
5. 35
均值 3
2. 2 Alcalase 碱性内切酶水解 SPI 条件的优化 SPI 的四级结构对酶解有很强的抵抗力 ,因此要
加快酶解速度 、提高 SPI 水解度必须考虑对大豆蛋白 进行预处理 ,使大豆蛋白高度压缩 、紧密的结构松散 开 ,暴露出分子内部的酶作用位点 ,有利于同蛋白酶 的结合 。采取物理 、化学等方法对 SPI 进行预处理 , 可以加速酶解过程的进行 。考虑到酸或碱处理过的
国内外对利用蛋白酶提高大豆蛋白的溶解性方 面做了相应研究 。Danji Fukushima 等[6] 在豆奶中加 入蛋白酶 ,使豆奶中大豆蛋白分子适度降解 ,然后再 喷雾干燥成豆奶粉 ,此种豆奶粉在速溶性 、耐热性和 除腥味方面都有较大幅度的改善 。K. Surówka 等[7] 利用 Protamex 和 Neutrase 对大豆浓缩蛋白进行限制 性水解 ,结果表明 Protamex 对改善大豆浓缩蛋白溶解 性和其它功能性质要优于 Neutrase 。李亚娜等[8] 通 过 Alcalase 对大豆分离蛋白 ( SPI) 进行轻度改性 ,研 究了大豆水解蛋白 ( ESPI) 的溶解度和其他功能性质 随水解度变化的趋势 ,并且对改性后 SPI 在高蛋白奶 中的应用做了相应的研究 。
水解度测定采用茚三酮法[9] 。 1. 3. 4 溶解度的测定[10 ]
准确称取 100 mg 样品 ,加入 15 mL 蒸馏水 ,用 0. 1 mol/ L HCl 或 NaOH 调节 pH 到预定值 ,室温下磁 力搅拌 30 min ,离心 (4 000 r/ min ,30 min) 。凯氏定氮 法测定该 pH 条件下可溶性蛋白质含量及总氮含量 。
从表 4 可以看出 ,在影响 DH 的五个因素中 ,影 响程度大小为 D > B > C > E > A ,最优水平组合为 A1B3C3D3 E3 ,即底物浓度 3 % ,反应温度为 60 ℃,反应 时间 3 h ,酶用量 4 500 U/ g ,反应 pH 为 8. 0 ,在此条件 下 ,可得到大豆分离蛋白的水解度为 8. 27 % ,溶解度 为 92. 72 %。但考虑到底物浓度低时虽然水解度和 溶解度较高 ,但是水解蛋白液中的蛋白质浓度也低 , 这会给实际应用带来诸多不便 ,因此提高底物浓度 并保持较高溶解度是适合的 。结果表明 ,将 3 %的底 物浓度增至 9 %时 ,其水解度可达 7. 93 % ,溶解度可 达 92. 17 % ,水解液中的蛋白浓度提高了 6 % ,因此 , 适宜的水解条件为底物浓度 9 % ,反应温度为60 ℃, 反应时间 3 h ,酶用量 4 500 U/ g ,反应 pH 为 8. 0 。 2. 3 ESPI 溶解性与 DH 关系的数学模拟
关键词 大豆分离蛋白 水解 Alcalase 溶解性 中图分类号 : TS201. 2 文献标识码 :A 文章编号 :1003 - 0174 (2009) 07 - 0037 - 04
蛋白质的溶解性是蛋白质所有功能性质中最重 要的性质 。作为食品蛋白原料 ,在生产过程中由于 酸沉等变性作用造成蛋白质的溶解性较差 ,而在其 添加到肉制品或饮料等生产过程中 ,由于溶解性差 、 分散性不良 ,限制了其添加量和使用范围[1] 。并且 溶解性影响着蛋白质的其他功能性质 ,如乳化性 、起 泡性和凝胶性等[2 - 4] ,对蛋白质在食品工业中的稳 定性 、风味等也有直接影响[5] 。
表 2 Alcacase 酶水解 SPI L16 (4) 5 因素水平编码表
序号 底物浓度 /%
温度 /℃
时间 酶用量
/h
/ U/ g
pH
1
3
40
1
1 5002
3 000
7
3
7
60
3
4 500
8
4
9
70
4
6 000
9
表 3 Alcacase 碱性内切酶水解 SPI 正交试验结果
底物 温度 时间
蛋白酶 ,采用底物浓度 5 % ,酶与底物浓度 ( E/ S) 比为
3 % ,分别在其最适反应条件下 (如表 1) ,对 SPI 进行 水解 ,比较其 DH 和溶解度 ,结果如图 1 所示 。
表 1 工业上常用的蛋白酶和其应用特性
名称
Alcalase 中性蛋白酶
Flavourzyme 木瓜蛋白酶
来源 地衣芽胞杆菌 解淀粉芽胞杆菌
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中国粮油学报
2009 年第 7 期
人适量蒸馏水 ,在 85 ℃水浴搅拌预处理 15 min ,然后 加入反应器中 400 r/ min 搅拌均质 ,并冷却到酶解反 应温度 ,用 4 mol/ L NaOH 调到反应的最适 pH ,依据 所用酶的活力 ,准确量取蛋白酶加入到反应器中 ,反 应过程中及时滴加 4 mol/ L NaOH ,使 pH 恒定 ,并使 温度始终保持在酶解的最适温度 。反应到预定时 间 ,迅速升温到 90 ℃,加热 15 min ,钝化蛋白酶 。 1. 3. 3 水解度 (DH) 的测定
大豆蛋白在酶解前要进行中和操作 ,产生大量的盐 , 本研究采用热处理的方法 , 热处理 温 度 为 85 ℃, 10 min[11 ] 。
在酶催化水解反应中 ,诸多因素影响反应的进 行 ,如水解 pH、温度 、水解时间 、底物浓度及酶的添加 量等 ,必须确定适当的参数来满足较快水解的要求 。 我们采用 L16 (4) 5 正交表 ,以水解度 (DH) 和蛋白质溶 解度为指标 ,拟定出试验方案 (见表 2) 来考察五个因 素对水解的影响 ,结果见表 3 和表 4 。
8 5 70 3 3 000 6 3. 83 ±0. 06 81. 27 ±0. 26
9 7 40 3 6 000 7 5. 27 ±0. 09 85. 89 ±0. 29
10 7 50 4 4 500 6 5. 96 ±0. 08 87. 73 ±0. 29
11 7 60 1 3 000 9 4. 63 ±0. 06 83. 84 ±0. 26