实验一酶催化蔗糖转化反应

实验一酶催化蔗糖转化反应（~28学时）

一、目的和要求

1．用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。

2．了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。

3．学会米氏常数的测定。

二、实验原理

蔗糖转化反应

蔗糖＋水——→葡萄糖＋果糖

这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。

溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度与反应物浓度C成线形关系，即

＝kC

作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成物的葡萄糖也是右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为－91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到最大值。

三、仪器和试剂

旋光仪1台

恒温槽1套

葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯）

醋酸－醋酸钠缓冲溶液

四、实验步骤

1．蔗糖酶的提取

取鲜酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，搅拌15～20分钟后使团块液化，再加3 mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37℃保温60小时左右。取出后加入3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右。将混合物以每分钟3000转的速度离心30分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，再以同样速度离心30分钟，所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品。将此蔗糖酶用pH＝4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存。

2．作蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线

根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：

y ＝－60.28x ＋

其中 x －蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M ）

y －蔗糖转化进程中体系的旋光度值

－不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算。 ＝66.6×L ×C （L ＝10cm ，C 是蔗糖浓度g/mL ）

通过上述的直线方程，可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值，求出其转化成葡萄糖的浓度x ，从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度。

3． 酶比活性的测定

配制2.5％的蔗糖溶液100 mL ，测定其旋光度。在20℃的条件下加入蔗糖酶5 mL ，反应3分钟测定体系旋光度值y ，用公式 y ＝－60.28x ＋ 求出葡萄糖浓度x ，及生成葡萄糖的毫克数，即可求出酶的比活性。（上述方法制备的酶，其活性约每毫升20单位。）

比活性(单位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)

4． 蔗糖酶进程曲线的制作

取200 mL 0.1 M 的蔗糖溶液，在35℃水浴条件下恒温，加10 mL 蔗糖酶溶液，每5分钟取出20 mL 反应液加5滴5 M NaOH 灭活后，测定一次体系的旋光度。求出葡萄糖的浓度，用葡萄糖的浓度对时间作图，得到蔗糖酶催化反应的进程曲线。

5． 蔗糖酶米氏常数的测定

用缓冲溶液稀释0.5 M 的蔗糖溶液成为一系列不同浓度的蔗糖溶液各50 mL ，在35℃恒温条件下加入10 mL 已知活性的蔗糖酶，反应5分钟，加入1 mL 5 M NaOH 溶液终止反应，测定此时溶液的旋光度，从而求出葡萄糖的生成速度V ，根据米氏方程

max m V )S

V (K V +-= 用反应速度V 对（V/S ）作图，直线的斜率-K m ，直线的截距为V max ，从而可以求出米氏常数K m 。

五、数据处理

1．利用(3)中的数据计算酶的比活性。

2．利用(4)中的数据作酶催化反应进程曲线。

3．利用(5)中的数据计算蔗糖酶米氏常数。

六、参考文献

[1] 沈同等，“生物化学”，上册，人民教育出版社，1980年版。

[2] 复旦大学，“物理化学实验”，上册，人民教育出版社，1979年版。

[3] 朱俭等，“生物化学实验”，上海科技出版社，1981年版。

附录一 直线

直线方程一般可表示为：

y ＝a ＋bx （1）

式中y 和x 为由实验数据可确定的量；a 和b 为待定参数或函数。例如，对Arrhenius 公式指数式，y 和x 分别为lnk 和1/T ；a 和b 分别为lnA 和（－E/k ）。对式[lnr=lnk ＋nlnC]，y 和x 分别为lnr 和lnC ；a 和b 分别为lnk 和n 。

由于有实验误差，用n 对由实验确定的y i 与x i 值作y 对x 图时，一般说来，所得各点并不严格的在同一直线上，于是存在着这样的问题：应如何更合理地作出直线，从而更准确地求解a 和b 的值？应当指出，若直线选择不当（直线位置画的不当），不大的偏离，将可能导致a 和b 重大偏差。尤其是当试验测定的x 区间范围相对较小时，外推至x ＝0，将可使截距a 产生较大的误差。

例如依Arrhenius 对数式以lnk 对1/T 作图，由实验测定的温度范围外推至1/T ＝0，即T ＝∞时，所选的直线斜率的较小的偏差将会引起截距lnA 产生很大的偏差，致使指前因子A 产生更大的偏差。

怎样方能使直线位置选择（画）的得当呢？通俗地说，实测点（y i ~x i ）应均匀分布在直线两侧。严格的说，可采用下述“最小二乘法”确定最佳a 、b 值，作出最佳直线。

若取得的数据实验值y i 与x i （i=1、2、…n ），一般来说，y i 与a ＋bx i 值并不相等，令其误差为i ，则

i =y i ―a ―bx i

线性回归，要求适当选择a 与b 之值，使各对元数据的偏差i 之平方和之值为最小。即

∑∑==--==n 1

i 2i i n 1i 2

i

)bx a (y δS ∑==---=∂∂n 1

i i i 0)bx a (y 2a S （2） ∑==---=∂∂n 1i i i i 0)x bx a (y 2b S （3）

式中y i 、bx i 均为已知值。令y 与x 分别为y i 与x i 的平均值。

∑==n

1

i i y n 1y