葡聚糖检测方法

葡聚糖检测方法（试剂盒方法翻译）
一．提供试剂
瓶1：exo-1,3-β-Glucanase (100 U/mL) plus β-Glucosidase(20 U/mL) suspension, 2.0 mL
瓶2：Amyloglucosidase (1630 U/mL) plus invertase(500 U/mL) solution in 50 % v/v glycerol, 20 mL
瓶3：GOPOD Reagent Buffer. Buffer (48 mL,pH 7.4), p-hydroxybenzoic acid and sodium azide(0.4 % w/v).
瓶4：GOPOD Reagent Enzymes. Glucose oxidaseplus peroxidase and 4-aminoantipyrine. Freeze-dried powder.
瓶5：D-Glucose standard solution (5 mL, 1.00 mg/mL) in0.2 % w/v benzoic acid
瓶6：Contr ol yeast β-glucan preparation ( 2 g, β-glucan content stated on the bottle label).
二．提供试剂的处理
1.向瓶1中加入8ml醋酸钠缓冲液，分装-20℃存放。

2.直接使用瓶2中的试剂，稳定在4°C ~ 2年或者-20°C > 4年。

3.将瓶3的GOPOD试剂用纯化稀释水定容到1L，稳定在4°C > 2年。

4.将瓶4的GOPOD试剂用纯化稀释水定容到1L，黑暗环境存
放，稳定在4 °C 2 - 3个月,在-20°C或> 12个月。

5.直接使用瓶5中的试剂，在室温下稳定> 4年。

6.直接使用瓶6中的试剂，在室温下稳定> 5年。

三．未提供试剂的制备（缓冲液的配置）
1.醋酸钠缓冲液(200 mM, pH 5.0)
在900ml去离子水中加11.6ml冰醋酸(1.05 g/mL)，用4M氢氧化钠(16 g/100 mL)调节ph=5.0，4℃存放。

2.醋酸钠缓冲液(1.2 M, pH
3.8)
在800ml去离子水中加入69.6ml冰醋酸，用4M氢氧化钠(16 g/100 mL)调节ph=3.8，室温存放。

3.氢氧化钾(2 M)
在800ml去离子水中加入112g氢氧化钾溶解，室温保存。

4.盐酸(37 % v/v; ~10 M)在室温下稳定> 10年
四．检测空白试剂的配置
1.试剂空白
0.2ml醋酸钠缓冲液(200 mM, pH 5.0)，再加入3mlGOPOD 试剂。

2. 葡萄糖标准
0.1ml葡萄糖标准溶液（1mg/ml）和0.1ml缓冲液(200 mM, pH 5.0)再加入3.0mlGOPOD试剂溶液。

五．测量1、3:1、6-β-GLUCAN ，待测样品的准备工作A：测量总葡聚糖
1.粉碎待测样品。

过20-30目筛。

2.准确称取100mg粉碎的待测样，到培养管，保证样品沉到培养管底部。

3.向培养管中加浓盐酸(37 % v/v)，封口，使用漩涡混合器充分混合。

置30℃水浴锅中水浴45min，每15分钟混合一次（保证完全溶解样品）
4.在每个培养管中加入10ml去离子水，混合均匀。

5.在100℃沸水浴中培养2h。

6.冷去至室温，加入10ml氢氧化钾(2 M)。

7.用醋酸钠缓冲液(200 mM, pH 5.0)定容至100ml，冲洗培养管，混合均匀。

8.1800r/min,离心10 min，得离心液。

9.移取0.1ml离心液到试管（俩份）。

10.加入0.1ml瓶1的处理液，并在40℃水浴1h。

11.加入3mlGOPOD试剂，在40℃下水浴20min。

12.测量在510nm的吸光度。

B：α-Glucan的含量测定
1.准确称取100mg粉碎的待测样，到培养管，保证样品沉到培养管底部。

2.加入2 M氢氧化钾溶液2ml，冰浴搅拌混匀20min。

3.添加8毫升1.2m醋酸钠缓冲(pH= 3.8)搅拌。

立即加入0.2ml瓶2试剂，搅拌均匀，在40℃水浴30min，间歇使用涡旋混合器混
合。

4.样品包含> 10%α-glucan时，将上述溶液转移到100毫升容量瓶(使用洗瓶水)定容，混合好，1800r/min,离心10 min。

5.样品包含< 10%α-glucan时，这样的样品大约是最后的体积10.3毫升，1800r/min,离心10 min（无稀释）
6.移取0.1ml离心液到试管（俩份）。

7.加入0.1ml瓶1的处理液，加入3mlGOPOD试剂，在40℃下水浴20min
8.测量在510nm的吸光度。

六．计算公式以及说明
总葡聚糖(% w/w)=ΔE x F/W x 90.
α-葡聚糖(% w/w)=ΔE x F/W x 90 (final volume 100 ml)
= ΔE x F/W x 9.27 (final volume 10.3 ml)
β-Glucan =Total Glucan -α-Glucan
备注：ΔE=样品OD-空白OD
F=?
W=样品称取质量。