真菌葡聚糖酶活力测定

前 言

本标准与Novozymes A/S标准方法：EB-SM-0572.02/02 FBG. Fungal Beta-Glucanase activity by Konelab analyzer(英文版)的一致性程度为等同。

附录A为规范性附录。

本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司提出。

本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司负责起草。

本标准主要起草人：蔺继尚、关越、翟文景。

本标准于2004年04月首次发布。

诺维信分析方法

第112部分：用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力，FBG

1 范围

本方法规定了使用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力的步骤。

本方法适用于所有Novozymes内部分析真菌β-葡聚糖酶样品的实验室。

2 原理

β-葡聚糖酶能水解β-葡聚糖，生成还原糖。该反应通过加入含有PAHBAH和铋盐（Bi3+）的碱性溶液中止。含有的PAHBAH和铋盐能与还原糖形成有颜色的混合物，在405nm下检测。生成的颜色与β-葡聚糖酶活力成比例。该过程由Konelan分析仪自动完成。

2.1 反应条件(反应体系中)

酶反应

β-葡聚糖浓度： 0.50%

β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L

缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液

pH： 5.0

温度: 50℃

时间: 20 min

酶空白反应

β-葡聚糖浓度： 0.50%

β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L

缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液

pH： 5.0

温度: 50℃

时间: 20 min

显色反应

PAHBAH浓度： 42 mM

酒石酸盐浓度： 56 mM

铋盐浓度： 4.5 mM

NaOH浓度： 146 mM

pH： 碱性

温度: 50℃

时间: 20 min

测定波长： 405 nm

2.2 样品条件(样品溶液中)

工作范围： （6-30）FBG/L

Q/12KF 3568.112-2004

定量范围： （13-30）FBG/L

3 单位定义

1 FBG等于在给定条件下每分钟生成相当于1µmol葡萄糖的还原糖所需的酶的量。该活力相对于一个Novozymes A/S标准酶测得。

4 样品类型

本方法适用于最终成品，同样也适用于来自发酵、回收和研发的样品。

5 专一性和灵敏度

如果样品在405 nm处有天然的高本底，或样品中酶活力较低而含的还原糖较多，这些都会导致本方法失效。上述情况会掩盖真实的样品本底，这些情况可从实验中不正常的高吸光度发现。

未稀释样品的检测限为6 FBG/L。定量限为13 FBG/L或0.13 FBG/g（样品稀释为1 g到10 mL）。

方法的灵敏度为：0.064 [0.043-0.085] A/(FBG/L)。

6 仪器

Konelab 30分析机，Thermo Clinical Labsystems

稀释器，Hamilton Microlab 1000

分析天平

pH计

7 试剂

7.1 FBG-B（磷酸缓冲液，33mM，pH 5.0）

如配制2 L：

Na2HPO4y2H2O ………………………………………………………………… (0.0960±0.0005) g KH2PO4…………………………………………………………………………… (8.9864±0.0005) g 去离子水 ……………………………………………………………………………… 加至 2 000 mL 贮存：室温下2周。

7.2 FBG-A（β-葡聚糖，5.9 g/L）

如配制50 mL：

β-葡聚糖（诺维信标准底物） ………………………………………………… (0.2950±0.0005) g FBG-B（溶液7.1） ………………………………………………………………………… 约40 mL 搅拌加热到90℃至溶解，然后冷却到室温。调节溶液的pH到5.00±0.05。

FBG-B（溶液7.1） ……………………………………………………………………… 加至 50 mL 贮存：室温下24小时。

7.3 Brij溶液（225 mg/L）

如配制1 L：

Brij 35（30%） ………………………………………………………………………………… 750 µL 去离子水 ……………………………………………………………………………… 加至 1 000 mL 贮存：室温下24小时。

7.4 NaOH溶液（500 mM）

取清洁的锥形瓶到天平上，回零。取4片氢氧化钠到锥形瓶中，计重量为W。然后加入去离子水。最终的重量为50W±0.01 g。

贮存：室温下8小时。

Q/12KF 3568.112-2004 7.5 PAHBAH溶液

如配制25 mL：

PAHBAH ……………………………………………………………………………… 0.5000±0.0005 g 酒石酸钾钠 ………………………………………………………………………… 1.2500±0.0005 g 醋酸铋 ……………………………………………………………………………… 0.1380±0.0005 g NaOH（溶液7.4）……………………………………………………………………………… 加至25 mL 贮存：铝膜避光。室温下24小时，或溶液从无色变为浅黄色。

8 样品和标准

样品的储备液在室温下可贮存8小时。在Konelab样品杯中的样品最终稀释液在室温下可贮存8小时。

8.1 标准

储备液

精确称取（1.3941±0.0005）g的Energex标准品93-11101（标识酶活215.2 FBG/g）到100 mL的容量瓶中。用Brij溶液（溶液7.3）定容。搅拌15 min溶解。然后再用Brij溶液（溶液7.3）稀释10倍备用。

酶标准溶液

按下表用Brij溶液（溶液7.3）稀释储备液到终体积25 mL，得到标准曲线：

FBG/L 储备液，mL 稀释倍数

6 0.5 50

12 1.0 25

17.6 1.467 17

23.1 1.925 13

30 2.5 10

8.2 标准对照

在每次分析中使用一个Celluclast标准对照品。

标准对照品用Brij溶液（溶液7.3）稀释到最终浓度在标准曲线的范围之内。

精确称取（1.0000±0.0005）g的Celluclast标准品3-1196到100 mL的容量瓶中。用Brij溶液（溶液7.3）定容。搅拌15 min溶解。然后再用Brij溶液（溶液7.3）稀释300倍备用。

8.3 样品

样品至少稀释：

——固体样品：25倍；

——液体样品：10倍。

如：

称取（1.0±0.1000）g的样品到100 mL的容量瓶中，记重。用Brij溶液（溶液7.3）定容。搅拌15 min 溶解。CT型的颗粒样品一般要溶解在250 mL的容量瓶中，用Brij溶液（溶液7.3）搅拌溶解2小时。最后按估计活性再用Brij溶液（溶液7.3）稀释到活性约为20（范围12-30）FBG/L。

9 试验步骤

9.1 样品的设置

标准、标准对照和样品按如下顺序放置：

——位置1-5：标准（浓度从低到高）；

——位置6：标准对照；

——位置7及以后：样品。

一次分析最多能分析37个样品（包括标准和标准对照）。

9.2 Konelab的设定