真菌葡聚糖酶活力测定

前 言
本标准与Novozymes A/S标准方法：EB-SM-0572.02/02 FBG. Fungal Beta-Glucanase activity by Konelab analyzer(英文版)的一致性程度为等同。

附录A为规范性附录。

本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司提出。

本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司负责起草。

本标准主要起草人：蔺继尚、关越、翟文景。

本标准于2004年04月首次发布。

诺维信分析方法
第112部分：用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力，FBG
1 范围
本方法规定了使用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力的步骤。

本方法适用于所有Novozymes内部分析真菌β-葡聚糖酶样品的实验室。

2 原理
β-葡聚糖酶能水解β-葡聚糖，生成还原糖。

该反应通过加入含有PAHBAH和铋盐（Bi3+）的碱性溶液中止。

含有的PAHBAH和铋盐能与还原糖形成有颜色的混合物，在405nm下检测。

生成的颜色与β-葡聚糖酶活力成比例。

该过程由Konelan分析仪自动完成。

2.1 反应条件(反应体系中)
酶反应
β-葡聚糖浓度： 0.50%
β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L
缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液
pH： 5.0
温度: 50℃
时间: 20 min
酶空白反应
β-葡聚糖浓度： 0.50%
β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L
缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液
pH： 5.0
温度: 50℃
时间: 20 min
显色反应
PAHBAH浓度： 42 mM
酒石酸盐浓度： 56 mM
铋盐浓度： 4.5 mM
NaOH浓度： 146 mM
pH： 碱性
温度: 50℃
时间: 20 min
测定波长： 405 nm
2.2 样品条件(样品溶液中)
工作范围： （6-30）FBG/L
Q/12KF 3568.112-2004
定量范围： （13-30）FBG/L
3 单位定义
1 FBG等于在给定条件下每分钟生成相当于1µmol葡萄糖的还原糖所需的酶的量。

该活力相对于一个Novozymes A/S标准酶测得。

4 样品类型
本方法适用于最终成品，同样也适用于来自发酵、回收和研发的样品。

5 专一性和灵敏度
如果样品在405 nm处有天然的高本底，或样品中酶活力较低而含的还原糖较多，这些都会导致本方法失效。

上述情况会掩盖真实的样品本底，这些情况可从实验中不正常的高吸光度发现。

未稀释样品的检测限为6 FBG/L。

定量限为13 FBG/L或0.13 FBG/g（样品稀释为1 g到10 mL）。

方法的灵敏度为：0.064 [0.043-0.085] A/(FBG/L)。

6 仪器
Konelab 30分析机，Thermo Clinical Labsystems
稀释器，Hamilton Microlab 1000
分析天平
pH计
7 试剂
7.1 FBG-B（磷酸缓冲液，33mM，pH 5.0）
如配制2 L：
Na2HPO4y2H2O ………………………………………………………………… (0.0960±0.0005) g KH2PO4…………………………………………………………………………… (8.9864±0.0005) g 去离子水 ……………………………………………………………………………… 加至 2 000 mL 贮存：室温下2周。

7.2 FBG-A（β-葡聚糖，5.9 g/L）
如配制50 mL：
β-葡聚糖（诺维信标准底物） ………………………………………………… (0.2950±0.0005) g FBG-B（溶液7.1） ………………………………………………………………………… 约40 mL 搅拌加热到90℃至溶解，然后冷却到室温。

调节溶液的pH到5.00±0.05。

FBG-B（溶液7.1） ……………………………………………………………………… 加至 50 mL 贮存：室温下24小时。

7.3 Brij溶液（225 mg/L）
如配制1 L：
Brij 35（30%） ………………………………………………………………………………… 750 µL 去离子水 ……………………………………………………………………………… 加至 1 000 mL 贮存：室温下24小时。

7.4 NaOH溶液（500 mM）
取清洁的锥形瓶到天平上，回零。

取4片氢氧化钠到锥形瓶中，计重量为W。

然后加入去离子水。

最终的重量为50W±0.01 g。

贮存：室温下8小时。

Q/12KF 3568.112-2004 7.5 PAHBAH溶液
如配制25 mL：
PAHBAH ……………………………………………………………………………… 0.5000±0.0005 g 酒石酸钾钠 ………………………………………………………………………… 1.2500±0.0005 g 醋酸铋 ……………………………………………………………………………… 0.1380±0.0005 g NaOH（溶液7.4）……………………………………………………………………………… 加至25 mL 贮存：铝膜避光。

室温下24小时，或溶液从无色变为浅黄色。

8 样品和标准
样品的储备液在室温下可贮存8小时。

在Konelab样品杯中的样品最终稀释液在室温下可贮存8小时。

8.1 标准
储备液
精确称取（1.3941±0.0005）g的Energex标准品93-11101（标识酶活215.2 FBG/g）到100 mL的容量瓶中。

用Brij溶液（溶液7.3）定容。

搅拌15 min溶解。

然后再用Brij溶液（溶液7.3）稀释10倍备用。

酶标准溶液
按下表用Brij溶液（溶液7.3）稀释储备液到终体积25 mL，得到标准曲线：
FBG/L 储备液，mL 稀释倍数
6 0.5 50
12 1.0 25
17.6 1.467 17
23.1 1.925 13
30 2.5 10
8.2 标准对照
在每次分析中使用一个Celluclast标准对照品。

标准对照品用Brij溶液（溶液7.3）稀释到最终浓度在标准曲线的范围之内。

精确称取（1.0000±0.0005）g的Celluclast标准品3-1196到100 mL的容量瓶中。

用Brij溶液（溶液7.3）定容。

搅拌15 min溶解。

然后再用Brij溶液（溶液7.3）稀释300倍备用。

8.3 样品
样品至少稀释：
——固体样品：25倍；
——液体样品：10倍。

如：
称取（1.0±0.1000）g的样品到100 mL的容量瓶中，记重。

用Brij溶液（溶液7.3）定容。

搅拌15 min 溶解。

CT型的颗粒样品一般要溶解在250 mL的容量瓶中，用Brij溶液（溶液7.3）搅拌溶解2小时。

最后按估计活性再用Brij溶液（溶液7.3）稀释到活性约为20（范围12-30）FBG/L。

9 试验步骤
9.1 样品的设置
标准、标准对照和样品按如下顺序放置：
——位置1-5：标准（浓度从低到高）；
——位置6：标准对照；
——位置7及以后：样品。

一次分析最多能分析37个样品（包括标准和标准对照）。

9.2 Konelab的设定
Q/12KF 3568.112-2004
将溶液FBG-A、FBG-B和PAHBAH分别放置在Konelab的溶液容器中。

选择FBG程序。

FBG的Konelab试验定义见附录A。

9.3 Konelab自动分析步骤
步骤 描述
1 温控装置升温到50℃
2 加110 µL的FBG-A到一个空的比色皿中
3 加110 µL的FBG-B到另一个空的比色皿中
4 两比色皿在50℃预热480 s
5 分别加入20 µL的样品
6 混合均匀
7 50℃反应1200 s
8 分别加入60 µL的PAHBAH
9 混合均匀
10 50℃再次反应1200 s
11 读取溶液的吸光度
12 计算：“结果”= FBG-A的吸光度 - FBG-B的吸光度
9.4 Konelab信号
“主空白”在Konelab真实样品模式中被叫做“结果”。

该值是所有信号（酶反应信号+β-葡聚糖本底+样品本底）减去样品本底得来的。

β-葡聚糖本底被保留在所有的结果中。

这个本底会在从标准曲线上读数据的时候消除掉。

在工作单上记下“结果”。

如果标准5的“结果”大于3.5，则重新试验。

如果样品的“结果”超出标准曲线范围，则重新稀释样品。

Konelab的操作见文件：EB-TE-0001.02。

10 计算
10.1 标准曲线
以标准点的浓度（FBG/L）为X轴、“结果”为Y轴绘制标准曲线。

标准曲线为一次曲线。

步骤 描述
1 从Konelab上读取标准点的“结果”
2 标准曲线为 S = A + B x “结果”，其中：
3 S = 标准点的活力，FBG/L
4 A = 标准曲线的截距
5 B = 标准曲线的斜率，(FBG/L)/Abs
6 “结果”= 样品Konelab试验的吸光度
7 标准曲线的相关系数r2应大于0.990。

10.2 样品
步骤 描述
1 从标准曲线的2-5之间读取未知样品的吸光度
2 按上式计算S。

10.3 样品
Q/12KF 3568.112-2004
依下式计算未稀释样品的活力： FBG/g = 1000
×××W F V S 式中：
S —— 标准曲线上读出的分析结果（FBG/L）
V —— 容量瓶的体积（mL）
F —— 多次稀释倍数
W —— 样品称重（g）
1 000 —— mL到L的换算因子
结果给出3位有效数字。

11 精确度和准确度
单次测定的变异系数（CV%）在方法确认实验中为2.5%。

方法的重复性为3.3%。

12 存档
所有文件按照本地SOP的要求存档。

13 意外情况 所有与此SOP不符的情况须与负责的化学工程师讨论并记录在案。

Q/12KF 3568.112-2004
附 录 A
（规范性附录）
Konelab试验定义
表1 Konelab试验定义
Full name EB-SM-0572
Online Name FBG Test in use YES
Test type Photometric LOW H IGH
*
Abs/min
0.00000
Test
limit
Result unit Abs/min Initial absorbance. 0.000 * A
Number of Decim. 5 Dilution limit * * Abs/min
Secondary dil 1+ 0.0 0.0
limit * * Abs/min
Critical
Reflex test limit * * Abs/min
test
Reflex
Acceptance Automatic Reference class LOW H IGH In Use
Dilution 1+ 0.0
Sample type Sample type 5 Correction factor 1.00
Abs/min
0.00
bias
Correction
°C
Temperature
50.0
Calibration type None
Factor 1.00 Bias 0.00
Bias correction in use NO
Manual QC in use NO Routine QC in use NO
Blank Sample
cuvette
Fixed
(ul)
110
Reagent FBG-A Volume
Disp. with Extra Add. Volume (ul) 50
Wash reagent FBG-B Repl. reagent FBG-B
480
(sec.)
Incubation Time
Q/12KF 3568.112-2004
表1（续）
20
Sample Volume
(ul)
Disp. with Extra Add. Volume (ul) 50
Wash reagent Water Wash reagent None
1200
(sec.)
Incubation Time
60
(ul)
Reagent PAHBAH
Volume
Disp. with Extra Add. Volume (ul) 50
Wash reagent None
point
Measurement End
Wavelength (nm) 405 Side wavel. (nm) None
Meas. type Fixed timing
━━━━━━━━━━━━。