真菌葡聚糖酶活力测定
β-葡聚糖酶活性测定
β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。
由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。
在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。
真菌d葡聚糖实验室检测方法
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
β-葡聚糖酶活力测定
β-葡聚糖酶活力测定方法• 1 原理•β-葡聚糖酶(EC.3.2.1.6)水解1，3（4）-β-D-葡聚糖苷键，放出还原糖基团与3，5-二硝基水杨酸(DNS试剂)发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖的含量成正比关系，在540nm测其光的吸收值，查标准曲线（以葡萄糖计），可得到还原糖的量，据此计算β-葡聚糖酶的活力。
• 2 仪器和设备• 2.1 分析天平：精度0.0001g• 2.2 恒温水浴：精度±0.2℃• 2.3 计时表• 2.4 分光光度计• 2.5 沸水浴器• 2.6 振荡混合器• 2.7 pH计: 精度0.01pH单位• 3 试剂和溶液• 3.1 0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）•溶液A:量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
•溶液B:称取8.2g醋酸钠，溶解定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
•使用时以A:B =3:7的比例混合，低温冷藏备用。
• 3.2 1%的β—葡聚糖溶液的配制•准确称取0.25gβ—葡聚糖放入100ml锥形瓶中，加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。
加20ml无离子水混合15分钟，盖紧塞子在沸水中煮5分钟，放置室温自然冷却，或用自来水流水降温。
将已冷却到室温的底物溶液倾入一只25ml容量瓶中，加入2.5ml1M醋酸缓冲液（pH5.0），并用无离子水定容到25ml。
• 3.3 3,5—二硝基水杨酸（DNS）溶液•溶液A:称分析纯的NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3,5－二硝基水杨酸。
•溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
•将A、B溶液混合，加入1200ml水，定容5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。
• 3.4 0.1%苯甲酸• 0.1g苯甲酸加入大约80ml无离子水中溶解，用无离子水定容至100ml。
真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测操作SOP文件--血清
真菌（1-3）-β-D葡聚糖测定规范操作1.目的建立真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测标准操作规范，保证实验结果的准确性。
2.授权操作人经培训合格的微生物实验室检验人员。
3.实验原理（1-3）-β-D葡聚糖检测原理：真菌（1-3）-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的G因子后形成凝固蛋白，根据其所引起的浊度变化对真菌（1-3）-β-D葡聚糖浓度进行定量测定。
4．产品性能指标4.1 灵敏度10pg/ml4.2 精密度批内差CV≤10% 。
4.3 准确性回收率75-125%。
4.4 标准曲线相关系数r绝对值≥0.9805．实验组成5.1实验仪器及器具：MB-80微生物快速动态检测系统、洁净工作台、低速离心机、恒温仪，20~200µl加样器、100~1000µl加样器、旋涡混合器、定时器。
5.2实验耗材：200µl无热原吸头、1000µl无热原吸头、无热原平底试管、无热原真空采血管。
5.3试剂盒组成：真菌（1-3）-β-D 葡聚糖检测试剂盒（光度法）：试剂盒包括反应主剂和样品处理液。
6．工作环境相对湿度：20%~80%；温度控制：10~30℃；电源电压：220V±10%，50Hz±2%。
7．标本采集及保存7. 1检测样本：血液、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等。
7.2采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管。
常规病人早上用药治疗前采血/取样（血透患者透析前采血）。
7.3样本保存：样本采集后应在3000转/分离心10分钟，若不能及时检测，应将血清转移至无热原转移管内，在-20℃冰箱中冷冻保存，一周内使用，实验之前取出复溶。
8．操作程序8.1 打开MB-80微生物快速动态检测系统主机、电脑及恒温仪预热30min。
8.2 打开MB-80微生物快速动态检测系统软件，录入病人信息、样本种类及检测项目等信息后点击采集。
8.3 血液前处理过程，无菌操作，用专用无热原真空采血管抽取静脉血4ml轻轻混匀，按转速3000r/min离心10分钟。
真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测操作SOP文件
声明本产品属精密光学仪器，在日常使用中，应严格按照我公司出具的操作流程进行试验操作，并确保工作环境正常。
本试验的操作者必须为经我公司培训合格的微生物实验室检验人员，如需更换操作者，请做好交接工作，确保新的操作者了解仪器特性、熟悉操作流程。
为避免试验结果不准确，请操作者认真阅读操作注意事项及操作流程，并严格遵守。
如有任何疑问，请联系我公司售后服务部。
售后服务部电话：400-811-9958北京金山川科技发展有限公司真菌（1-3）-β-D葡聚糖测定1.目的建立真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测标准操作规范，保证实验结果的准确性。
2.授权操作人经培训合格的微生物实验室检验人员。
3.实验原理（1-3）-β-D葡聚糖检测原理：真菌（1-3）-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的G因子后形成凝固蛋白，根据其所引起的浊度变化对真菌（1-3）-β-D葡聚糖浓度进行定量测定。
（1-3） -D-Glucan活化因子G 因子G凝固酶原凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）4．产品性能指标4.1 灵敏度最小检出值5pg/ml5．实验组成5.1实验仪器及器具：MB-80微生物快速动态检测系统、洁净工作台、低速离心机、恒温仪， 20~200ul 加样器、100~1000ul加样器、旋涡混合器、定时器。
5.2实验耗材：200ul无热原吸头、1000ul无热原吸头、无热原平底试管、无热原真空采血管。
5.3试剂盒组成：真菌（1-3）-β-D 葡聚糖检测试剂盒（光度法）：试剂盒包括反应主剂和样品处理液。
6．工作环境相对湿度：20%~80%；温度控制：10~30℃；电源电压：220V±10%，50Hz±2%。
7．标本采集、处理及保存7.1检测样本：血液、肺泡盥洗液、胸腔积液、腹水、脑脊液、尿液（无菌取中段尿或穿刺尿）7.2采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管（肝素类抗凝）。
常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患者透析前采血）。
病原菌细胞壁诱导下球毛壳菌葡聚糖酶活测定及抑菌试验
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显 。在 ６种植 物病 原真 菌细胞壁 诱 导下 ， 球毛 壳 菌可产生 Ｂ一１３一葡聚糖 酶 ， ， 但是 产 酶规律 不 同。
在稻 瘟病 菌 、 立枯 丝核 菌和 尖孢 镰 刀 茵细胞 壁诱 导 下 ， Ｂ一１ ３一葡聚 糖 酶 活要 明 显 高 于杨树 烂 皮 ，
病菌、 核盘 茵和 叶枯 茵。其 中 ， 稻 瘟病 茵 细胞壁诱 导 ｌ 在 １ ｄ后 ， 酶活 达到最 高 ， ０ ６ 而杨树 烂 为 ． １Ｕ； 皮病 菌和 叶枯 茵细胞壁 的诱 导产酶 效果 最差。球毛 壳 菌可作 为生物防 治真 菌。 关 键词 ： 毛 壳菌 ； 球 生物 防 治 ； Ｂ一１３一葡聚糖酶 ， 中图分类 号 ：７ ３ １ ￥６．５ 文献标 识码 ： Ａ 文章编号 ：０ ３— １９ ２ １ ） ３— ０ ０— ４ １０ ７ ７ （０ ０ ０ ０ ５ ０
真菌 D葡聚糖检测反应机理
真菌(1-3)-?-D葡聚糖检测反应机理目前临床上随着广谱抗生素、各类免疫抑制剂、移植插管等新技术的不断发展应用,其真菌感染尤其是深部真菌感染出现明显上升趋势,而作为临床诊断的细菌培养其阳性率很低,且检测周期长,不能适应临床治疗诊断的要求,因此迫切需要快速、准确的检测方法.因此对血液中的早期(1-3)-?-D 葡聚糖快速定量检测,将对临床对症治疗具有很深的现实意义。
人体血浆中(1-3)-?-D葡聚糖快速检测对早期诊断深部真菌感染具有重要的参考价值。
该试验的基本原理是试剂中含凝固酶原及凝固蛋白原的冷冻干燥品. 在适宜条件下, 微量(1-3)-?-D葡聚糖能激活试剂中的凝固酶原产生凝集反应,通过测定凝集反应过程中的浊度变化从而定量检测血浆中(1-3)-?-D葡聚糖含量.内毒素定量检测的反应机理细菌内毒素作为革兰阴性菌细胞壁外层中的脂多糖成份(LPS), 具有多种的生物活性, 微量的内毒素进入机体将会出现发热、血压降低、寒战、引起DIC、内毒素败血症等一系列临床反应, 因此对血液中的早期内毒素快速定量检测,将对临床对症治疗具有很深的现实意义。
人体血浆中内毒素检测对分别诊断革兰阴性杆菌感染具有重要的参考价值。
反应试剂中含凝固酶原及凝固蛋白原的冷冻干燥品. 在适宜条件下, 微量革蓝氏阴性菌内毒素能激活试剂中的凝固酶原产生凝集反应形成凝胶,通过测定在形成凝胶过程中的浊度变化从而定量检测血浆中革蓝氏阴性菌内毒素.一、检测体液内毒素的临床意义由革兰氏阴性菌所引起的内毒素血症及脓毒血症是目前临床上的主要死亡原因之一。
在各类抗生素杀灭革兰氏阴性菌的同时，也会使后者释放出一定数量的内毒素，从而加重内毒素血症。
早期诊断的细菌学培养需时长，而且由于抗生素的应用，其培养阳性率低。
早期的数小时内作为临床上抢救感染性休克的关键，临床医师仅能根据临床特征与体征推断病源学而带有一定的盲目性，因此，早期体液中内毒素的正确、快速定量检测及相应的对症治疗就显得格外重要。
β-葡聚糖测定方法
β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004)∙ 1.原理β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。
还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂反应显色反应。
反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。
∙ 2. 操作∙ 2.1.标准葡萄糖曲线的制作2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min。
用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。
2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL葡萄糖标准溶液。
2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。
电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。
然后用自来水冷却到室温，在用水定溶液至25mL。
以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。
以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线∙ 3. 酶样测定吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。
吸取10.0经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。
然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml，37℃保温30min,沸水浴加热5min。
真菌(1-3)-β-D葡聚糖
附1真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测标准操作规程1.目的规范真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测的操作规程，保证结果准确性。
2.原理实验条件下，来源于某些真菌细胞壁的(1-3)-β-D葡聚糖能够特异性地激活本试剂盒反应试剂的酶促凝集系统，使反应溶液的透光度发生变化。
利用(1-3)- β-D葡聚糖标准品建立β-D-葡聚糖生物效应与透光度变化关系的标准曲线，便可定量地测定人血液的(1-3)- β-D葡聚糖含量。
3.试剂真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测试剂盒，湛江安度斯生物有限公司。
试剂盒包装规格：20人份/盒。
复溶后的试剂溶液应在10分钟内使用。
若当次试验有剩余，可将剩余的试剂溶液置-20℃以下冷冻保存，一周内使用。
不能反复冻融试剂溶液。
4.检测设备：LKM动态试管检测仪。
5.实验用具：250 μl无热原吸头、20-200 μl移液器、75℃试管恒温仪、旋涡混合器、塑料试管架、无热原真空采血管（肝素抗凝剂）。
6.标本采集及送检要求6.1标本采集要求6.1.1采集过程要求无菌操作，用指定的肝素类抗凝、无菌、无β葡聚糖采血管；6.1.2常规住院病人早上用药前空腹采血，血透患者透析前采血。
6.2标本的送检和保存要求标本采集后应在半小时内离心，4小时内检测完。
若当日不能及时检测的标本应将离心后的血浆转移至无β葡聚糖的容器内-20℃以下冷冻保存，一周内使用。
7.实验操作7.1在试验开始前，先开启LKM动态试管检测仪，预热，一段时间后发出哔的一声，试管仪温度达到37℃，待用；7.2取本试剂盒所配的无热原真空采血管取受试者静脉血1～2 ml，以400 g离心10分钟；7.3取富含血小板的血浆100 μl，加到样品稀释瓶中，在旋涡混合器上轻轻混匀，然后插入75℃试管恒温仪中加热10分钟；7.4加热10分钟后，将样品稀释瓶从75℃试管恒温仪中取出，使其降至室温即可，即为1:10稀释的样品供试溶液；7.5取β-G试剂1支，开启；7.6取β-G试剂复溶液1支，开启后用移液器取0.25 ml加入β-G试剂中，轻轻摇匀，澄清后得试剂溶液备用；7.7打开检测软件连接LKM动态试管检测仪，进入临床检查采集数据界面，点击“开始”按钮，使检测软件进入待采集状态；7.8取本试剂盒所配的专用反应试管，先取已制备好的样品供试溶液100 μl加入反应试管中，然后加入50 μl试剂溶液，每个样品供试品溶液平行两管；7.9加样完毕，依次拿起试管在旋涡混合器上轻点一下，使试管中的溶液均匀混合，然后把各试管逐一插到LKM动态试管仪中，反应开始，37℃反应75分钟，在反应结束前填写试验相关的信息；7.10反应完毕，检测软件将自动处理数据，计算出样品供试溶液中的（1-3）-β-G葡聚糖测量值，进入“临床检查数据报告”可查看检验结果，进入“临床检查数据分析”可查看反应曲线。
真菌β-D-葡聚糖检测与真菌感染诊断
真菌β-D-葡聚糖检测与真菌沾染诊断一.概述经研讨标明,(1-3)-β-D-葡聚糖是一种普遍消失于真菌细胞壁的抗原成分, 占其湿润重量的80%～90%,其它微生物.动物及人的细胞成分和细胞外液均不含有.深部真菌沾染患者中血浆(1-3)-β-D-葡聚糖含量增高,两者消失相干性.当真菌进入人体血液或深部组织后,经吞噬细胞的吞噬.消化代谢后,（1-3）-β-D葡聚糖可从胞壁中释放出来,从而使血液或其它体液中（1-3）-β-D葡聚糖含量增高.当真菌在体内含量削减时,机体免疫可敏捷对其消除.而在浅部真菌沾染中,（1-3）-β-D葡聚糖未被释放出来,故其在体液中的量不增高,它在血液及无菌体液中的消失可以很大程度上视为IFI（深部真菌沾染）的标记.二.深部真菌沾染的诊治近年来,因为造血干细胞移植.实体器官移植的普遍开展.高强度免疫克制剂和大剂量化疗药物的运用以及各类导管的体内介入.留置等,临床上侵袭性真菌沾染(invasive fungal infections,IFI)的患病率显著上升.IFI也日益成为导致骨髓及器官移植受者.接收化疗的恶性血液病和恶性肿瘤患者.AIDS以及其他危宿疾患者的轻微并发症及重要逝世亡原因之一.因为缺乏有用的早期诊断手腕,深部真菌沾染病逝世率居高不下.对深部真菌沾染治疗成败的症结在于早期诊断,及早用药治疗.通例病原学诊断“微生物造就”可为临床供给直接的诊断根据,但其造就办法耗时长（4-7天）,不合适用作早期诊断.并且,跟着光谱抗生素.抗菌药物的大量运用,使得造就的阳性率极低.经常运用的免疫学办法,也因为抗原抗体反响的特异性差,往往对某一疑似真菌沾染患者要作多种真菌抗原或抗体检测,既费时又不经济,并且当所用药盒的抗原谱或抗体谱不全时也极易造成漏诊.对一些以往接触过响应真菌抗原的个别,作抗体检测时还会消失阳性反响,因而反抗体的检测往往请求作动态不雅察才干作出诊断,期末属性较差.有研讨报导血清葡聚糖在念珠菌血症时显著升高,将其用于念珠菌血症的早期诊断显著优于传统的造就法和血清学诊断实验.固然检测（1-3）-β-D葡聚糖只能提醒有无真菌侵袭性沾染,不克不及肯定为何种真菌,但也可能转化为一种优势.因近年来,一些罕有的前提致病真菌也可引起深部沾染,这就请求一种能敏捷肯定有无深部真菌沾染的办法.因体系抗真菌药物种类较少,抗菌谱较广,且不因真菌种类而异,当检测到标本中的（1-3）-β-D葡聚糖含量较高时,可赐与以体系治疗,不必耗时等待判定出种属,不然会贻误最佳治疗机会.是以,血清（1-3）-β-D葡聚糖含量检测不掉为一种适用的真菌沾染早期诊断办法.并且,相干研讨标明,（1-3）-β-D葡聚糖程度在确诊IFI患者的血清中消失中断升高,而跟着药物的运用,对药物迟钝者可很快消失（1-3）-β-D葡聚糖程度降低及转阴,而药物治疗无效人群（1-3）-β-D葡聚糖值无显著转变.是以,（1-3）-β-D葡聚糖可以用来断定药物的疗效,以协助临床医师实时进行药物种类及剂量的调剂.经由过程对人体体液进行（1-3）-β-D葡聚糖含量检测,可帮忙断定人体是否已被真菌沾染.对高危患者的样本进行中断剖析,可为临床检测供给入侵真菌的量值或阴性预示值,为临床诊断和治疗供给了一种快速检讨办法,对进步病人治疗治愈率和指点大夫合理用药,以及促进我国医疗事业的成长具有重要意义.三.国表里相干成长情形今朝,临床上诊断侵袭性真菌沾染(invasive fungal infections,IFI)的办法重要由宿主身分.临床特点.微生物学检讨和组织病理学4部分构成.血液.支气管肺泡灌洗液中的各类真菌PCR测定,是诊断IFI的微生物学的检测办法.但传统真菌判定办法都因周期长.血造就率低而难于快速诊断.研讨者也逐渐将早期诊断的留意力转向树立血清学办法来检测真菌菌体成分或代谢产品,如测定白念珠菌的甘露聚糖.烯醇化酶.D-阿拉伯糖醇等.鉴于深部真菌沾染时,经吞噬细胞处理,菌胞壁降解成分大量入血,90年月初,有学者树立了以检测血浆或血清中真菌胞壁成分曲霉半乳甘露聚糖抗原(GM)和(1-3)-β-D葡聚糖抗原[(1-3)-β-D-gluean,BG]的含量, 用于早期诊断深部真菌沾染具有较好敏锐度和特异性,且敏捷.轻便,并能提醒抗真菌药物治疗.BG检测(也称G实验)是一种新的真菌抗原检测办法,重要由以下研讨机构开展,日本东京Wako纯化学研讨所,Seikagaku Kogyo公司,Ma-ruha公司和美国Cape Code协会.个中Cape Code协会研制的Fungitell试剂盒已被美国FDA同意用于血液病.肿瘤等免疫受损的患者IFI的诊断.BG是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分,作为真菌抗原具有较高的特异性,原核生物.病毒和人体细胞都不消失这种多聚糖.是以,它在血液及无菌体液中的消失可以很大程度上视为IFI的标记.真菌细胞壁的重要成分BG的比色法检测试剂盒已普遍用于临床.美国FDA已于2003年同意该实验用于可疑IFI患者血清定性检测.2008年欧洲肿瘤研讨治疗组织(EORTC)IFI合作组(IFICG)和国度过敏及沾染类疾病研讨(NIAID)真菌病研讨组(MSG)将G实验成果列为诊断IFI的诊断尺度,但试剂盒必须是FDA认证的.国外多个研讨中间为评估该实验的特点已做了大量的回想性查询拜访,证实其迟钝度.特异度及临床一致性均较好.编辑： gaowei2010 起源：丁喷鼻园。
β-葡聚糖酶活性测定
β葡聚糖是由葡萄糖单体通过β，和β，糖苷键连接而成地型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中地糊粉层和胚乳细胞壁中.β葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β葡聚糖分子中地β，和β，糖苷键，使之降解为小分子.由于在饲料中，大麦地β葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分地消化利用具有明显地干扰和抑制作用，成为麦类饲料中地抗营养因子.在饲料中添加β葡聚糖酶，能有效地消除β葡聚糖地抗营养作用，促进饲料中各种养分地消化和吸收利用，增进畜禽健康.在啤酒生产中，添加β葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒地过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖地含量.此外，β葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛地应用，对β葡聚糖酶地研究将越来越受到人们地重视.β葡聚糖酶活力地测定方法主要有种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法.其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用地一种酶活测定方法.其原理是：β葡聚糖酶能将β葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有地还原基团在沸水浴条件下可与试剂发生显色反应，显色地深浅与还原糖量成正比，而还原糖地生成量又与反应液中β葡聚糖酶地活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液地吸光度值来计算还原糖地生成量，从而得出β葡聚糖酶地活力.但在该测定方法地具体操作中存在一些影响酶活力测定结果地因素，本文即对还原糖法测定β葡聚糖酶活力地几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件.材料与方法菌株与培养基发酵产酶菌株黑曲霉（）菌株，由本实验室保藏.固态发酵培养基麸皮、米糠、、微量元素液、蒸馏水，值，℃灭菌.微量元素液地组成为：溶液、、·、、、蒸馏水.发酵培养条件三角瓶装培养基（干料计），接种量为每瓶孢子悬液(×)，发酵温度℃，培养.试剂与溶液β葡聚糖溶液准确称取β葡聚糖()，加入无水乙醇润湿，再加入缓冲液，同时缓慢加热直至β葡聚糖完全溶解，冷却至室温，用缓冲液定容至，底物溶液℃保存，内用完.葡萄糖标准贮备溶液( )称取烘干至恒重地无水葡萄糖，精确至，用水溶解并定容至.葡萄糖标准溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液、、、、、、于容量瓶中，用水定容至，盖塞，摇匀备用.试剂称取，二硝基水杨酸，置于约水中，逐渐加入氢氧化钠，在℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠、苯酚(重蒸) 和无水亚硫酸钠，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至，过滤.贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置后使用.粗酶液地制备取固体发酵曲于三角瓶中，加入缓冲液，振荡抽提，过滤离心去除孢子后，℃保存备用.缓冲液乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲配制液见叶宝兴主编《生物科学基础实验》（）.标准曲线地制作方法按表规定地量，分别吸取葡萄糖标准溶液、缓冲溶液和试剂于各管中（每管做个平行样），混匀.将标准管同时置于沸水浴中，反应.取出，迅速冷却至室温，用水定容至，盖塞，混匀.在波长处测量吸光度.以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程.酶活力测定方法取支刻度具塞试管，分别加入β葡聚糖底物溶液（由值乙酸乙酸钠缓冲液配制），置℃水浴中保温.在其中一支试管中加入稀释酶样，混匀，置于℃水浴中准确反应，加入试剂至两支试管中，混匀.在另一支试管(空白管)中加入稀释酶样，同时将两支试管放入℃水浴中反应，取出置于冷水中冷却至室温，加水定容至，盖塞混匀，在处测量酶样对空白地吸光度，计算酶活力.酶活力计算标准曲线：.式中：——吸光度；——葡萄糖量()；——斜率；——截距.式中：——与μ之间地换算系数；——酶液稀释倍数；——葡萄糖分子量；——测定所取酶液量()；——反应时间（）.β葡聚糖酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解β葡聚糖产生μ还原糖（以葡萄糖计）所需地酶量，定义为一个酶活力单位（）.结果与讨论最佳吸收波长地确定按照上述标准曲线地制作方法，分别测定在不同波长处地吸光度，制作标准曲线，见表、图.在分光比色测定时，波长地选择不仅需要考虑灵敏度，同时还要考虑数据地稳定性和重复性.试验测定了不同波长处地值制作标准曲线.由表、图可以看出，在相同地糖浓度时，随着波长地升高，值呈下降趋势.在波长为时，测得地值最大，灵敏度最高，但数据地稳定性较差;在波长为时，测得数据地稳定性较好，但是灵敏度偏低；在波长为时，测得地数据灵敏度较高，而且稳定性也较好.所以，最佳测定波长确定为.线性回归方程为：，.葡萄糖沸水浴显色反应时间地确定分别以种不同浓度地葡萄糖标准溶液与试剂经沸水浴显色反应发现，沸水浴时间不同对显色反应结果影响较大，如图所示，种糖浓度反应结果相似，均为在～之间，反应速度较快，值增加幅度较大；～之间，反应趋于平缓，值增加缓慢；以后，所测得地值基本保持不变，说明显色反应已经完全，因此，沸水浴显色时间确定为.酶活力测定底物浓度地确定底物浓度是决定酶解反应速度地重要因素.测定β葡聚糖酶活力时底物浓度一般配制在之间，这个浓度范围达到了酶活力测定时底物过量地要求，既可保证酶和底物地充分反应，又可降低底物中小分子低聚糖对测定结果地影响，试验选用底物浓度为.酶活力测定反应时间地确定（见图）不同种类地酶其线性反应时间地范围也不同，在酶地线性反应时间内测定地酶活力较为准确.在相同反应体系下，试验测定了酶解反应从～时产生地还原糖地量.由图可以看出，酶解产生地还原糖在前内线性关系较好，产物生成量与反应时间成正比，在～之间产物生成速率逐渐减慢，以后产物生成量几乎不再增加.因此在～时处于一级反应阶段，产物生成速度一致，是酶活力测定地最佳时间，但反应时间短产物含量低时测定酶活力，会受到粗酶液中其它水解酶作用或底物纯度等因素对酶活力测定带来地干扰，选择产物生成量在以上地时间比较好，因此应选择作为酶活力测定地反应时间.酶活力测定缓冲液种类地确定（见图）缓冲液地种类和值对酶地活性影响较大，同一种酶在不同缓冲液和不同值时测定地活性不同.只有在某种缓冲液和某种值范围内才表现出最大活性.一般认为酶分子处在最适值时，其活性基团地解离状态最易与底物结合，而处在其它值时，改变了活性基团地解离状态，酶和底物结合减弱，活性就降低.由图可知，试验测定了种不同缓冲液体系条件下地酶活，随着值地增大，种缓冲液体系测得地酶反应活性均呈现出先增加后下降地趋势，但乙酸乙酸钠缓冲液体系测得地酶活力明显高于其它两种缓冲液体系.因此，在β葡聚糖酶活力测定时应选用乙酸乙酸钠缓冲液体系.酶活力测定最佳值地确定选择乙酸乙酸钠缓冲液体系，其它反应条件不变，改变缓冲液体系值进行酶活力测定，如图所示，当值为时，测得地值最大，酶活力最高.因此，酶活力测定应在值时进行.酶活力测定反应温度地确定（见图）酶解反应时地温度对酶反应速度影响较大，当其它条件不变时，温度每改变℃，反应速度可相差以上.本文在乙酸乙酸钠缓冲液值时，测定了不同温度条件下酶解反应时地产物生成量，如图所示，随着温度地升高，测得地值呈现先升高后下降地趋势，在温度为℃时，测得地值最大，产物生成量最多，酶活力最高.因此，β葡聚糖酶活力测定应在℃下进行.结论通过以上对还原糖法β葡聚糖酶活力测定条件地研究，可以看出在进行酶活力测定时，测定波长、沸水浴显色时间、底物浓度、酶解反应时间、反应缓冲液种类以及反应值均对酶活力测定有较大影响.经试验确定β葡聚糖酶活力地最佳测定条件为：β葡聚糖底物浓度，值乙酸乙酸钠缓冲体系，酶解反应温度℃，酶解反应时间，沸水浴显色，测定波长.。
葡聚糖酶酶活测定
八、Beta—葡聚糖酶活力的测定方法1 方法：3，5—二硝基水杨酸比色法，简称DNS法。
2 原理：还原糖能将3，5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3—胺基5—硝基水杨酸。
溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。
3. 主要仪器和设备天平（感量1mg和0.1mg两种），离心机，恒温水浴锅，磁力搅拌器,分光光度计（722型，符合GB9721的有关规定）。
4. 试剂和溶液4.1 所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水, 化学药品除特别要求外,均为分析纯。
4.2 DNS试剂称取3，5—二硝基水杨酸10g加入500 ml水中，分多次加入氢氧化钠16g，搅拌溶解(温度＜45℃)，再分多次加入酒石酸钾钠300g，搅拌至全溶，冷却后用水定容至1000ml。
室温下棕色瓶储存暗处放置，一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。
4.3 0.1mol/L，pH5.0醋酸—醋酸钠缓冲液吸取冰醋酸1.8ml于烧杯中,加适量水，加醋酸钠5.78g，溶解, 定容至1000ml，调节PH至5.00±0.01后使用。
室温下存放2个月有效。
4.4 0.1%即1mg/ml葡萄糖溶液无水葡萄糖于80℃烘至恒重，称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。
4.5 0.5%β—葡聚糖溶液称取β—葡聚糖0.50g于烧杯中,加入适量缓冲液，在沸水浴中搅拌加热溶解后，转入容量瓶中,用缓冲液(4.3)定容至100 ml,置2—8℃冰箱中备用。
有效期三天。
4.6 葡萄糖标准曲线的绘制吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于试管中，补水至2ml，加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度（A）。
以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y＝ax﹢b,求出吸光度与葡萄糖量的关系。
真菌(-3)-d葡聚糖检测反应机理
真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测反应机理目前临床上随着广谱抗生素、各类免疫抑制剂、移植插管等新技术的不断发展应用,其真菌感染尤其是深部真菌感染出现明显上升趋势,而作为临床诊断的细菌培养其阳性率很低,且检测周期长,不能适应临床治疗诊断的要求,因此迫切需要快速、准确的检测方法.因此对血液中的早期(1-3)-β-D葡聚糖快速定量检测,将对临床对症治疗具有很深的现实意义。
人体血浆中(1-3)-β-D葡聚糖快速检测对早期诊断深部真菌感染具有重要的参考价值。
该试验的基本原理是试剂中含凝固酶原及凝固蛋白原的冷冻干燥品. 在适宜条件下, 微量(1-3)-β-D葡聚糖能激活试剂中的凝固酶原产生凝集反应,通过测定凝集反应过程中的浊度变化从而定量检测血浆中(1-3)-β-D葡聚糖含量.内毒素定量检测的反应机理细菌内毒素作为革兰阴性菌细胞壁外层中的脂多糖成份(LPS), 具有多种的生物活性, 微量的内毒素进入机体将会出现发热、血压降低、寒战、引起DIC、内毒素败血症等一系列临床反应, 因此对血液中的早期内毒素快速定量检测,将对临床对症治疗具有很深的现实意义。
人体血浆中内毒素检测对分别诊断革兰阴性杆菌感染具有重要的参考价值。
反应试剂中含凝固酶原及凝固蛋白原的冷冻干燥品. 在适宜条件下, 微量革蓝氏阴性菌内毒素能激活试剂中的凝固酶原产生凝集反应形成凝胶,通过测定在形成凝胶过程中的浊度变化从而定量检测血浆中革蓝氏阴性菌内毒素.一、检测体液内毒素的临床意义由革兰氏阴性菌所引起的内毒素血症及脓毒血症是目前临床上的主要死亡原因之一。
在各类抗生素杀灭革兰氏阴性菌的同时，也会使后者释放出一定数量的内毒素，从而加重内毒素血症。
早期诊断的细菌学培养需时长，而且由于抗生素的应用，其培养阳性率低。
早期的数小时内作为临床上抢救感染性休克的关键，临床医师仅能根据临床特征与体征推断病源学而带有一定的盲目性，因此，早期体液中内毒素的正确、快速定量检测及相应的对症治疗就显得格外重要。
真菌β_D_葡聚糖检测与真菌感染诊断
真菌β-D-葡聚糖检测与真菌感染诊断一、概述经研究表明，(1-3)-β-D-葡聚糖是一种广泛存在于真菌细胞壁的抗原成分, 占其干燥重量的80%～90%，其它微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液均不含有。
深部真菌感染患者中血浆(1-3)-β-D-葡聚糖含量增高,两者存在相关性。
当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化代谢后，（1-3）-β-D葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液或其它体液中（1-3）-β-D葡聚糖含量增高。
当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速对其清除。
而在浅部真菌感染中，（1-3）-β-D葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高，它在血液及无菌体液中的存在可以很大程度上视为IFI（深部真菌感染）的标志。
二、深部真菌感染的诊治近年来，由于造血干细胞移植、实体器官移植的广泛开展、高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物的应用以及各种导管的体内介入、留置等，临床上侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的患病率明显上升。
IFI也日益成为导致骨髓及器官移植受者、接受化疗的恶性血液病和恶性肿瘤患者、AIDS以及其他危重病患者的严重并发症及重要死亡原因之一。
由于缺少有效的早期诊断手段，深部真菌感染病死率居高不下。
对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断，及早用药治疗。
常规病原学诊断“微生物培养”可为临床提供直接的诊断依据，但其培养方法耗时长（4-7天），不适宜用作早期诊断。
并且，随着光谱抗生素、抗菌药物的大量应用，使得培养的阳性率极低。
常用的免疫学方法，也由于抗原抗体反应的特异性差，往往对某一疑似真菌感染患者要作多种真菌抗原或抗体检测，既费时又不经济，而且当所用药盒的抗原谱或抗体谱不全时也极易造成漏诊。
对一些以往接触过相应真菌抗原的个体，作抗体检测时还会出现阳性反应，因而对抗体的检测往往要求作动态观察才能作出诊断，期末属性较差。
有研究报道血清葡聚糖在念珠菌血症时明显升高，将其用于念珠菌血症的早期诊断明显优于传统的培养法和血清学诊断试验。
真菌βD葡聚糖检测与真菌感染诊断
真菌β-D-葡聚糖检测与真菌感染诊断一、概述经研究表明,1-3-β-D-葡聚糖是一种广泛存在于真菌细胞壁的抗原成分, 占其干燥重量的80%～90%,其它微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液均不含有;深部真菌感染患者中血浆1-3-β-D-葡聚糖含量增高,两者存在相关性;当真菌进入人体血液或深部组织后,经吞噬细胞的吞噬、消化代谢后,1-3-β-D葡聚糖可从胞壁中释放出来,从而使血液或其它体液中1-3-β-D葡聚糖含量增高;当真菌在体内含量减少时,机体免疫可迅速对其清除;而在浅部真菌感染中,1-3-β-D葡聚糖未被释放出来,故其在体液中的量不增高,它在血液及无菌体液中的存在可以很大程度上视为IFI深部真菌感染的标志;二、深部真菌感染的诊治近年来,由于造血干细胞移植、实体器官移植的广泛开展、高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物的应用以及各种导管的体内介入、留置等,临床上侵袭性真菌感染invasive fungal infections,IFI的患病率明显上升;IFI也日益成为导致骨髓及器官移植受者、接受化疗的恶性血液病和恶性肿瘤患者、AIDS以及其他危重病患者的严重并发症及重要死亡原因之一;由于缺少有效的早期诊断手段,深部真菌感染病死率居高不下;对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断,及早用药治疗;常规病原学诊断“微生物培养”可为临床提供直接的诊断依据,但其培养方法耗时长4-7天,不适宜用作早期诊断;并且,随着光谱抗生素、抗菌药物的大量应用,使得培养的阳性率极低;常用的免疫学方法,也由于抗原抗体反应的特异性差,往往对某一疑似真菌感染患者要作多种真菌抗原或抗体检测,既费时又不经济,而且当所用药盒的抗原谱或抗体谱不全时也极易造成漏诊;对一些以往接触过相应真菌抗原的个体,作抗体检测时还会出现阳性反应,因而对抗体的检测往往要求作动态观察才能作出诊断,期末属性较差;有研究报道血清葡聚糖在念珠菌血症时明显升高,将其用于念珠菌血症的早期诊断明显优于传统的培养法和血清学诊断试验;虽然检测1-3-β-D葡聚糖只能提示有无真菌侵袭性感染,不能确定为何种真菌,但也可能转化为一种优势;因近年来,一些罕见的条件致病真菌也可引起深部感染,这就要求一种能迅速确定有无深部真菌感染的方法;因系统抗真菌药物种类较少,抗菌谱较广,且不因真菌种类而异,当检测到标本中的1-3-β-D葡聚糖含量较高时,可给予以系统治疗,不必耗时等待鉴定出种属,否则会贻误最佳治疗时机;因此,血清1-3-β-D葡聚糖含量检测不失为一种实用的真菌感染早期诊断方法;并且,相关研究表明,1-3-β-D葡聚糖水平在确诊IFI患者的血清中出现持续升高,而随着药物的使用,对药物敏感者可很快出现1-3-β-D葡聚糖水平下降及转阴,而药物治疗无效人群1-3-β-D 葡聚糖值无明显改变;因此,1-3-β-D葡聚糖可以用来判断药物的疗效,以协助临床医师及时进行药物种类及剂量的调整;通过对人体体液进行1-3-β-D葡聚糖含量检测,可帮助判断人体是否已被真菌感染;对高危患者的样本进行连续分析,可为临床检测提供入侵真菌的量值或阴性预示值,为临床诊断和治疗提供了一种快速检查方法,对提高病人治疗治愈率和指导医生合理用药,以及促进我国医疗事业的发展具有重要意义;三、国内外相关发展情况目前,临床上诊断侵袭性真菌感染invasive fungal infections,IFI的方法主要由宿主因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学4部分组成;血液、支气管肺泡灌洗液中的各种真菌PCR测定,是诊断IFI的微生物学的检测方法;但传统真菌鉴定方法都因周期长、血培养率低而难于快速诊断;研究者也逐渐将早期诊断的注意力转向建立血清学方法来检测真菌菌体成分或代谢产物,如测定白念珠菌的甘露聚糖、烯醇化酶、D-阿拉伯糖醇等;鉴于深部真菌感染时,经吞噬细胞处理,菌胞壁降解成分大量入血,90年代初,有学者建立了以检测血浆或血清中真菌胞壁成分曲霉半乳甘露聚糖抗原GM和1-3-β-D葡聚糖抗原1-3-β-D-gluean,BG的含量, 用于早期诊断深部真菌感染具有较好灵敏度和特异性,且迅速、简便,并能提示抗真菌药物治疗;BG检测也称G试验是一种新的真菌抗原检测方法,主要由以下研究机构开展,日本东京Wako 纯化学研究所,Seikagaku Kogyo公司,Ma-ruha公司和美国Cape Code协会;其中Cape Code 协会研制的Fungitell试剂盒已被美国FDA批准用于血液病、肿瘤等免疫受损的患者IFI 的诊断;BG是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分,作为真菌抗原具有较高的特异性,原核生物、病毒和人体细胞都不存在这种多聚糖;因此,它在血液及无菌体液中的存在可以很大程度上视为IFI的标志;真菌细胞壁的主要成分BG的比色法检测试剂盒已广泛用于临床;美国FDA已于2003年批准该试验用于可疑IFI患者血清定性检测;2008年欧洲肿瘤研究治疗组织EORTCIFI合作组IFICG和国家过敏及感染类疾病研究NIAID真菌病研究组MSG将G试验结果列为诊断IFI的诊断标准,但试剂盒必须是FDA认证的;国外多个研究中心为评估该试验的特性已做了大量的回顾性调查,证实其敏感度、特异度及临床一致性均较好;编辑： gaowei2010 来源：。
β-1,3-葡聚糖酶活性的测定
β-1，3-葡聚糖酶活性的测定在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1，3-葡聚糖酶。
该酶水解昆布多糖，内切β-1，3-葡萄糖苷键，产生还原末端。
可通过测定还原糖表示酶活力。
1.仪器设备恒温水浴、分光光度计、研钵、高速冷冻离心机、透析袋等。
2.操作方法1)试剂配制①铜试剂：称取12g酒石酸钾钠（NaKC4H4O3·4H2O），24g无水碳酸钠，16g碳酸氢钠，分别溶于200ml蒸馏水中后混匀。
另称硫酸铜4g（CuSO4·5H2O）溶于200ml蒸馏水，缓缓加入并搅拌到上述混合液中。
再称取无水硫酸钠180g，溶于其中，置沸水浴20min，冷却后过滤，最后定容至1000ml备用。
此液易出现结晶，应保存在20℃以上。
②砷钼酸试剂：25g钼酸铵[（NH4）6Mo7O24·4H2O]溶于450ml蒸馏水，加入22ml浓H2SO4，充分混匀。
另称取3g砷酸氢二钠（Na2HAsO4·7H2O），溶于25ml蒸馏水后，与上述钼酸铵溶液混合，37℃保温24~48h，贮于棕色瓶备用。
2）标准还原糖测定：将500μg/ml的葡萄糖溶液准确稀释至150μg/ml，用此再稀释成数种不同浓度的葡萄糖溶液。
然后取几支干净试管，分别加入不同浓度的葡萄糖溶液0.5ml，并加0.5ml铜试剂，置沸水浴10min后，自来水冷却。
加入0.5ml砷钼酸试剂，混匀，再加入3.5ml蒸馏水，于分光光度计660nm处测定光密度，并作光密度-还原糖浓度标准曲线。
3）酶蛋白的提取和活力测定①酶蛋白的提取：将植物材料加5倍量0.05mol/L的乙酸钠缓冲液（pH5.0），充分研磨，于15000×g 离心15min后，将上清液置透析袋中，用提取液在4℃下透析过夜。
经离心取上清液，放于冰箱备用。
②酶活力的测定：取0.4ml的1mg/ml昆布多糖（Sigma公司，溶于上述乙酸缓冲液），加入0.1 ml酶液，于37℃保温15min，立即加入0.5ml铜试剂，混匀，并于100℃水浴10min，置冷水中冷却，再加入0.5ml砷钼酸试剂，呈现蓝色后加蒸馏水3.5ml，660nm处比色，对照标准曲线求出样品液中的还原糖量。
真菌βD葡聚糖检测与真菌感染诊断
真菌β-D-葡聚糖检测与真菌感染诊断一、概述经研究表明,(1-3)-β-D-葡聚糖就是一种广泛存在于真菌细胞壁的抗原成分, 占其干燥重量的80%～90%,其它微生物、动物及人的细胞成分与细胞外液均不含有。
深部真菌感染患者中血浆(1-3)-β-D-葡聚糖含量增高,两者存在相关性。
当真菌进入人体血液或深部组织后,经吞噬细胞的吞噬、消化代谢后,(1-3)-β-D葡聚糖可从胞壁中释放出来,从而使血液或其它体液中(1-3)-β-D葡聚糖含量增高。
当真菌在体内含量减少时,机体免疫可迅速对其清除。
而在浅部真菌感染中,(1-3)-β-D葡聚糖未被释放出来,故其在体液中的量不增高,它在血液及无菌体液中的存在可以很大程度上视为IFI(深部真菌感染)的标志。
二、深部真菌感染的诊治近年来,由于造血干细胞移植、实体器官移植的广泛开展、高强度免疫抑制剂与大剂量化疗药物的应用以及各种导管的体内介入、留置等,临床上侵袭性真菌感染(invasive fungal infections,IFI)的患病率明显上升。
IFI也日益成为导致骨髓及器官移植受者、接受化疗的恶性血液病与恶性肿瘤患者、AIDS以及其她危重病患者的严重并发症及重要死亡原因之一。
由于缺少有效的早期诊断手段,深部真菌感染病死率居高不下。
对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断,及早用药治疗。
常规病原学诊断“微生物培养”可为临床提供直接的诊断依据,但其培养方法耗时长(4-7天),不适宜用作早期诊断。
并且,随着光谱抗生素、抗菌药物的大量应用,使得培养的阳性率极低。
常用的免疫学方法,也由于抗原抗体反应的特异性差,往往对某一疑似真菌感染患者要作多种真菌抗原或抗体检测,既费时又不经济,而且当所用药盒的抗原谱或抗体谱不全时也极易造成漏诊。
对一些以往接触过相应真菌抗原的个体,作抗体检测时还会出现阳性反应,因而对抗体的检测往往要求作动态观察才能作出诊断,期末属性较差。
有研究报道血清葡聚糖在念珠菌血症时明显升高,将其用于念珠菌血症的早期诊断明显优于传统的培养法与血清学诊断试验。
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前 言本标准与Novozymes A/S标准方法：EB-SM-0572.02/02 FBG. Fungal Beta-Glucanase activity by Konelab analyzer(英文版)的一致性程度为等同。
附录A为规范性附录。
本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司提出。
本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司负责起草。
本标准主要起草人：蔺继尚、关越、翟文景。
本标准于2004年04月首次发布。
诺维信分析方法第112部分：用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力，FBG1 范围本方法规定了使用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力的步骤。
本方法适用于所有Novozymes内部分析真菌β-葡聚糖酶样品的实验室。
2 原理β-葡聚糖酶能水解β-葡聚糖，生成还原糖。
该反应通过加入含有PAHBAH和铋盐（Bi3+）的碱性溶液中止。
含有的PAHBAH和铋盐能与还原糖形成有颜色的混合物，在405nm下检测。
生成的颜色与β-葡聚糖酶活力成比例。
该过程由Konelan分析仪自动完成。
2.1 反应条件(反应体系中)酶反应β-葡聚糖浓度： 0.50%β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液pH： 5.0温度: 50℃时间: 20 min酶空白反应β-葡聚糖浓度： 0.50%β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液pH： 5.0温度: 50℃时间: 20 min显色反应PAHBAH浓度： 42 mM酒石酸盐浓度： 56 mM铋盐浓度： 4.5 mMNaOH浓度： 146 mMpH： 碱性温度: 50℃时间: 20 min测定波长： 405 nm2.2 样品条件(样品溶液中)工作范围： （6-30）FBG/LQ/12KF 3568.112-2004定量范围： （13-30）FBG/L3 单位定义1 FBG等于在给定条件下每分钟生成相当于1µmol葡萄糖的还原糖所需的酶的量。
该活力相对于一个Novozymes A/S标准酶测得。
4 样品类型本方法适用于最终成品，同样也适用于来自发酵、回收和研发的样品。
5 专一性和灵敏度如果样品在405 nm处有天然的高本底，或样品中酶活力较低而含的还原糖较多，这些都会导致本方法失效。
上述情况会掩盖真实的样品本底，这些情况可从实验中不正常的高吸光度发现。
未稀释样品的检测限为6 FBG/L。
定量限为13 FBG/L或0.13 FBG/g（样品稀释为1 g到10 mL）。
方法的灵敏度为：0.064 [0.043-0.085] A/(FBG/L)。
6 仪器Konelab 30分析机，Thermo Clinical Labsystems稀释器，Hamilton Microlab 1000分析天平pH计7 试剂7.1 FBG-B（磷酸缓冲液，33mM，pH 5.0）如配制2 L：Na2HPO4y2H2O ………………………………………………………………… (0.0960±0.0005) g KH2PO4…………………………………………………………………………… (8.9864±0.0005) g 去离子水 ……………………………………………………………………………… 加至 2 000 mL 贮存：室温下2周。
7.2 FBG-A（β-葡聚糖，5.9 g/L）如配制50 mL：β-葡聚糖（诺维信标准底物） ………………………………………………… (0.2950±0.0005) g FBG-B（溶液7.1） ………………………………………………………………………… 约40 mL 搅拌加热到90℃至溶解，然后冷却到室温。
调节溶液的pH到5.00±0.05。
FBG-B（溶液7.1） ……………………………………………………………………… 加至 50 mL 贮存：室温下24小时。
7.3 Brij溶液（225 mg/L）如配制1 L：Brij 35（30%） ………………………………………………………………………………… 750 µL 去离子水 ……………………………………………………………………………… 加至 1 000 mL 贮存：室温下24小时。
7.4 NaOH溶液（500 mM）取清洁的锥形瓶到天平上，回零。
取4片氢氧化钠到锥形瓶中，计重量为W。
然后加入去离子水。
最终的重量为50W±0.01 g。
贮存：室温下8小时。
Q/12KF 3568.112-2004 7.5 PAHBAH溶液如配制25 mL：PAHBAH ……………………………………………………………………………… 0.5000±0.0005 g 酒石酸钾钠 ………………………………………………………………………… 1.2500±0.0005 g 醋酸铋 ……………………………………………………………………………… 0.1380±0.0005 g NaOH（溶液7.4）……………………………………………………………………………… 加至25 mL 贮存：铝膜避光。
室温下24小时，或溶液从无色变为浅黄色。
8 样品和标准样品的储备液在室温下可贮存8小时。
在Konelab样品杯中的样品最终稀释液在室温下可贮存8小时。
8.1 标准储备液精确称取（1.3941±0.0005）g的Energex标准品93-11101（标识酶活215.2 FBG/g）到100 mL的容量瓶中。
用Brij溶液（溶液7.3）定容。
搅拌15 min溶解。
然后再用Brij溶液（溶液7.3）稀释10倍备用。
酶标准溶液按下表用Brij溶液（溶液7.3）稀释储备液到终体积25 mL，得到标准曲线：FBG/L 储备液，mL 稀释倍数6 0.5 5012 1.0 2517.6 1.467 1723.1 1.925 1330 2.5 108.2 标准对照在每次分析中使用一个Celluclast标准对照品。
标准对照品用Brij溶液（溶液7.3）稀释到最终浓度在标准曲线的范围之内。
精确称取（1.0000±0.0005）g的Celluclast标准品3-1196到100 mL的容量瓶中。
用Brij溶液（溶液7.3）定容。
搅拌15 min溶解。
然后再用Brij溶液（溶液7.3）稀释300倍备用。
8.3 样品样品至少稀释：——固体样品：25倍；——液体样品：10倍。
如：称取（1.0±0.1000）g的样品到100 mL的容量瓶中，记重。
用Brij溶液（溶液7.3）定容。
搅拌15 min 溶解。
CT型的颗粒样品一般要溶解在250 mL的容量瓶中，用Brij溶液（溶液7.3）搅拌溶解2小时。
最后按估计活性再用Brij溶液（溶液7.3）稀释到活性约为20（范围12-30）FBG/L。
9 试验步骤9.1 样品的设置标准、标准对照和样品按如下顺序放置：——位置1-5：标准（浓度从低到高）；——位置6：标准对照；——位置7及以后：样品。
一次分析最多能分析37个样品（包括标准和标准对照）。
9.2 Konelab的设定Q/12KF 3568.112-2004将溶液FBG-A、FBG-B和PAHBAH分别放置在Konelab的溶液容器中。
选择FBG程序。
FBG的Konelab试验定义见附录A。
9.3 Konelab自动分析步骤步骤 描述1 温控装置升温到50℃2 加110 µL的FBG-A到一个空的比色皿中3 加110 µL的FBG-B到另一个空的比色皿中4 两比色皿在50℃预热480 s5 分别加入20 µL的样品6 混合均匀7 50℃反应1200 s8 分别加入60 µL的PAHBAH9 混合均匀10 50℃再次反应1200 s11 读取溶液的吸光度12 计算：“结果”= FBG-A的吸光度 - FBG-B的吸光度9.4 Konelab信号“主空白”在Konelab真实样品模式中被叫做“结果”。
该值是所有信号（酶反应信号+β-葡聚糖本底+样品本底）减去样品本底得来的。
β-葡聚糖本底被保留在所有的结果中。
这个本底会在从标准曲线上读数据的时候消除掉。
在工作单上记下“结果”。
如果标准5的“结果”大于3.5，则重新试验。
如果样品的“结果”超出标准曲线范围，则重新稀释样品。
Konelab的操作见文件：EB-TE-0001.02。
10 计算10.1 标准曲线以标准点的浓度（FBG/L）为X轴、“结果”为Y轴绘制标准曲线。
标准曲线为一次曲线。
步骤 描述1 从Konelab上读取标准点的“结果”2 标准曲线为 S = A + B x “结果”，其中：3 S = 标准点的活力，FBG/L4 A = 标准曲线的截距5 B = 标准曲线的斜率，(FBG/L)/Abs6 “结果”= 样品Konelab试验的吸光度7 标准曲线的相关系数r2应大于0.990。
10.2 样品步骤 描述1 从标准曲线的2-5之间读取未知样品的吸光度2 按上式计算S。
10.3 样品Q/12KF 3568.112-2004依下式计算未稀释样品的活力： FBG/g = 1000×××W F V S 式中：S —— 标准曲线上读出的分析结果（FBG/L）V —— 容量瓶的体积（mL）F —— 多次稀释倍数W —— 样品称重（g）1 000 —— mL到L的换算因子结果给出3位有效数字。
11 精确度和准确度单次测定的变异系数（CV%）在方法确认实验中为2.5%。
方法的重复性为3.3%。
12 存档所有文件按照本地SOP的要求存档。
13 意外情况 所有与此SOP不符的情况须与负责的化学工程师讨论并记录在案。
Q/12KF 3568.112-2004附 录 A（规范性附录）Konelab试验定义表1 Konelab试验定义Full name EB-SM-0572Online Name FBG Test in use YESTest type Photometric LOW H IGH*Abs/min0.00000TestlimitResult unit Abs/min Initial absorbance. 0.000 * ANumber of Decim. 5 Dilution limit * * Abs/minSecondary dil 1+ 0.0 0.0limit * * Abs/minCriticalReflex test limit * * Abs/mintestReflexAcceptance Automatic Reference class LOW H IGH In UseDilution 1+ 0.0Sample type Sample type 5 Correction factor 1.00Abs/min0.00biasCorrection°CTemperature50.0Calibration type NoneFactor 1.00 Bias 0.00Bias correction in use NOManual QC in use NO Routine QC in use NOBlank SamplecuvetteFixed(ul)110Reagent FBG-A VolumeDisp. with Extra Add. Volume (ul) 50Wash reagent FBG-B Repl. reagent FBG-B480(sec.)Incubation TimeQ/12KF 3568.112-2004表1（续）20Sample Volume(ul)Disp. with Extra Add. Volume (ul) 50Wash reagent Water Wash reagent None1200(sec.)Incubation Time60(ul)Reagent PAHBAHVolumeDisp. with Extra Add. Volume (ul) 50Wash reagent NonepointMeasurement EndWavelength (nm) 405 Side wavel. (nm) NoneMeas. type Fixed timing━━━━━━━━━━━━。