植酸酶的测定
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2、反应溶液pH的探讨
由上图可知，在PH为5左右时，植酸酶的活性达到最大，所以植酸酶缓冲液提供的的PH环境应在5左右
3、不同的离子及离子浓度对植酸酶活性的影响
由上图可知，Ca离子和Na离子对酶的活性影响最小，Zn离子和Cu离子对酶的活性抑制影响较大。
圆点系列表示Cu2+浓度对酶的活性的影响，随着Cu2+浓度增加，酶的活性增加；
四、结果计算和表示
1、植酸酶活性单位的定义
由已知的条件:植酸酶样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度45℃、pH值5的条件下,每1min从2.5mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷,即为一个植酸酶活性单位,以“U”表示。
2、X= ……………………………………………………(1)
式中：
X——试样中植酸酶的活性，单位为酶活性单位每克（U/g）或酶活性单位每毫升（U/ml）;
一、测定原理
钼黄法(偏钒酸铵法)原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钒钼酸铵处理生成黄色复合物,在415nm波长下进行比色分析。
二、反应条件的探讨
1、反应体系的温度及加热时间的探讨
由上图可知，在温度为45摄氏度左右时，植酸酶的活性达到最大，所以在酶促反应时应使温度稳定在45℃左右，植酸酶的作用效率才最大。
三角形系列表示Zn2+浓度对酶活性的影响，随着Zn2+浓度增加，酶的活性增加。
4、不同反应体系条件对植酸酶活性测定影响
图5所示为正交实验时，不同温度和pH的组合的条件下测得的植酸酶的比活性，在pH为5，温度在45℃左右时植酸酶活性达到最大。
5、酶促反应时间的确定
由上图可知，在0.5h以前，酶作用底物的速度呈直线关系，所以测定时反应的时间应该在30min左右。
6、反应初始底物浓度的确定
斜率=0.854523227
相关性=0.997923599
截距=3.383740831
根据上图可求得[Sm]=2.53mmol/L
7、酶的稳定性
由图可得，酶活性随时间而降低，故酶样品溶液需要现配现用
三、实验步骤
1、标准曲线的制作
准确称取0.680g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾（）于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L按下表的比例用乙酸缓冲液稀释成不同的浓度，与待测样一起反应测定。以无机磷酸的量为横坐标，吸光值为纵坐标，列出回归线方程（y=a+bx）。
标准稀释比例
标准溶液序号
ຫໍສະໝຸດ Baidu稀释量
浓度/(μmol/ml)
1
0.5→16
1.5625
2
0.5→8
3.1250
3
0.5→4
6.2500
4
0.5→2
12.5000
5
0.5→1
25.0000
2、取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，标准空白加入。2ml乙酸缓冲液。在反应过程中，从加入底物溶液开始，向每只试管中加入试剂的时间间隔要一致，在恒温水浴45℃水解30min。
9、混合
√
√
总体积
10ml
10ml
注：①终止及显色液：移取两份硝酸溶液（1+2水溶液），一份偏巩酸氨溶液混合后使用，现用现配。
②乙酸缓冲液,c=0.25mol/L:称取20.52g无水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解至刻度。
4、样品测定反应后的溶液在室温下静置10min，如出现浑浊需在离心机上离心去沉淀，上清以磷酸标准曲线空白调零，在分光光度计415波长处测定试样空白（A0）和是试样溶液（A）吸光值，A-A0为实测吸光度值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
3、反应步骤及试剂、溶液用量见表。
反应顺序
样品、标准
样品空白
1、加入乙酸缓冲液
1.9ml
1.9ml
2、加入酶液
0.1ml
0.1ml
3、混合
√
√
4、恒温水浴45℃预热5min
√
√
5、依次加入植酸溶液
4ml
4ml（第二步）
6、混合
√
√
7、恒温水浴45℃水解30min
√
√
8、依次加入终止及显色液
4ml
4ml（第一步）
由上图可知，在PH为5左右时，植酸酶的活性达到最大，所以植酸酶缓冲液提供的的PH环境应在5左右
3、不同的离子及离子浓度对植酸酶活性的影响
由上图可知，Ca离子和Na离子对酶的活性影响最小，Zn离子和Cu离子对酶的活性抑制影响较大。
圆点系列表示Cu2+浓度对酶的活性的影响，随着Cu2+浓度增加，酶的活性增加；
四、结果计算和表示
1、植酸酶活性单位的定义
由已知的条件:植酸酶样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度45℃、pH值5的条件下,每1min从2.5mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷,即为一个植酸酶活性单位,以“U”表示。
2、X= ……………………………………………………(1)
式中：
X——试样中植酸酶的活性，单位为酶活性单位每克（U/g）或酶活性单位每毫升（U/ml）;
一、测定原理
钼黄法(偏钒酸铵法)原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钒钼酸铵处理生成黄色复合物,在415nm波长下进行比色分析。
二、反应条件的探讨
1、反应体系的温度及加热时间的探讨
由上图可知，在温度为45摄氏度左右时，植酸酶的活性达到最大，所以在酶促反应时应使温度稳定在45℃左右，植酸酶的作用效率才最大。
三角形系列表示Zn2+浓度对酶活性的影响，随着Zn2+浓度增加，酶的活性增加。
4、不同反应体系条件对植酸酶活性测定影响
图5所示为正交实验时，不同温度和pH的组合的条件下测得的植酸酶的比活性，在pH为5，温度在45℃左右时植酸酶活性达到最大。
5、酶促反应时间的确定
由上图可知，在0.5h以前，酶作用底物的速度呈直线关系，所以测定时反应的时间应该在30min左右。
6、反应初始底物浓度的确定
斜率=0.854523227
相关性=0.997923599
截距=3.383740831
根据上图可求得[Sm]=2.53mmol/L
7、酶的稳定性
由图可得，酶活性随时间而降低，故酶样品溶液需要现配现用
三、实验步骤
1、标准曲线的制作
准确称取0.680g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾（）于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L按下表的比例用乙酸缓冲液稀释成不同的浓度，与待测样一起反应测定。以无机磷酸的量为横坐标，吸光值为纵坐标，列出回归线方程（y=a+bx）。
标准稀释比例
标准溶液序号
ຫໍສະໝຸດ Baidu稀释量
浓度/(μmol/ml)
1
0.5→16
1.5625
2
0.5→8
3.1250
3
0.5→4
6.2500
4
0.5→2
12.5000
5
0.5→1
25.0000
2、取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，标准空白加入。2ml乙酸缓冲液。在反应过程中，从加入底物溶液开始，向每只试管中加入试剂的时间间隔要一致，在恒温水浴45℃水解30min。
9、混合
√
√
总体积
10ml
10ml
注：①终止及显色液：移取两份硝酸溶液（1+2水溶液），一份偏巩酸氨溶液混合后使用，现用现配。
②乙酸缓冲液,c=0.25mol/L:称取20.52g无水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解至刻度。
4、样品测定反应后的溶液在室温下静置10min，如出现浑浊需在离心机上离心去沉淀，上清以磷酸标准曲线空白调零，在分光光度计415波长处测定试样空白（A0）和是试样溶液（A）吸光值，A-A0为实测吸光度值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
3、反应步骤及试剂、溶液用量见表。
反应顺序
样品、标准
样品空白
1、加入乙酸缓冲液
1.9ml
1.9ml
2、加入酶液
0.1ml
0.1ml
3、混合
√
√
4、恒温水浴45℃预热5min
√
√
5、依次加入植酸溶液
4ml
4ml（第二步）
6、混合
√
√
7、恒温水浴45℃水解30min
√
√
8、依次加入终止及显色液
4ml
4ml（第一步）