自身免疫性疾病的实验室检测

90年代--至今 基因重组和分子生物学技术技术开始应用
自身抗体研究和检测
自身抗体的分类
1、疾病标志性自身抗体：此类自身抗体只出现 于某种AID中，诊断价值大，如系统性红斑狼 疮的抗SM 抗体 2、疾病特异性自身抗体：此类自身抗体在某种 AID中敏感性高；在其他疾病也可出现，但敏 感性低，如系统性红斑狼疮的抗dsDNA 3、疾病相关性自身抗体：此类自身抗体与某种 AID密切相关，但在其他疾病也可出现，且有 一定的敏感性，如原发性干燥综合征中的抗 SSA抗体和抗SSB抗体
自身抗原
3、自身成分的改变
类风湿疾病：正常IgG发生变性形成靶抗原， 引发自身免疫性疾病的发生。
自身免疫性疾病的主要实验室检测项目
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自身抗体 免疫球蛋白 补体 淋巴细胞 细胞因子 循环免疫复合物 常规检查
自身免疫性疾病的自身抗体检测
自身抗体（autoantibody）
是指抗自身细胞内、细胞表面和细胞外抗 原的免疫球蛋白，是自身免疫和自身免疫病重 要特征之一，某些自身免疫病伴有特征性的自 身抗体谱
自身免疫性疾病的实验室诊断
信阳市中心医院检验科
陈永红
自身免疫性疾病
• 临床上有些疾病可明确诊断（如肺炎、肝炎、结 核病、艾滋病、肿瘤），还有许多疾病难以诊断 或治疗效果差，常常让临床医生感到棘手和困惑， 这就是自身免疫性疾病。
• 自身免疫性疾病(AID): 因自身免疫反应 导致组织器官损伤或功能障碍所致疾病。
免疫印迹法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离 按分子大小分开不同区带 转印 NC膜上 待检血清
抗ENA与膜上相应抗原带结合
抗人IgG· HRP NC—ENA—抗ENA—抗人IgG· HRP—显色
抗核抗体（ANA）的检测与应用
抗核抗体:以真核细胞的各种细胞核成分为靶抗原所检测的自身
抗体的总称。 传统定义：针对细胞核成分的自身抗体的总称。 广义定义：针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的 理 解不再局限于核成分，而是指核酸和核蛋白抗体的总称。 ANA主要是IgG，也有IgM、IgA、IgD和IgE；
检测方法及应用 检测方法及应用
• 间接免疫荧光检测：检测抗dsDNA抗体最特
异和最敏感的方法是用马疫锥虫或绿蝇短膜虫作 为抗原基质进行间接免疫荧光检测，是目前国内 外临床常规检测抗dsDNA抗体最常用的方法。
• 抗dsDNA抗体诊断SLE的特异性可达95%～100%，
但其敏感性仅为30%～50%，因此抗dsDNA抗体阴 性不能排除SLE的诊断。
检测自身抗体的方法
间接免疫荧光法（IIF） 酶联免疫吸附实验(ELISA) 免疫印迹法（Western-blot） 酶免疫斑点法 化学发光或电化学发光
生物芯片技术
间接免疫荧光法示意图
荧光标记抗体
病人血清（待检抗体） HEp-2细胞 肝组织切片
自身抗体荧光图片
均质型
核仁型
斑点型
着丝点型
自身抗体荧光图片 抗核糖体P蛋白（rib-P）抗体 抗线粒体抗体（AMA）
• • • • • 有五种荧光图形 1、均质型------抗DNA抗体（SLE) 2、核膜型---------抗组蛋白抗体（ SLE) 3、颗粒型-----抗非组蛋白抗体 4、核仁型-------抗核仁抗体(PSS) 5、着丝点型（PSS)
• 抗核抗体的荧光图形分类对了解自身免疫性疾 病的鉴别诊断具有提示作用，但要明确是哪一 亚类的自身抗体，必须作进一步的抗核抗体谱 系的检测，不能仅凭荧光核型作出相关自身抗 体的判断。
常见自身免疫性疾病的标志抗体
标志抗体 dsDNA 、Sm
SSB 着丝点抗体 Scl-70 抗体 AKA、抗CCP 抗体 Jo-1 抗体 RNP 抗体 肝肾微粒体抗体（LKM-1） 平滑肌抗体（SMA） AMA（M2）
相关疾病 系统性红斑狼疮SLE
干燥综合症SS 进行性系统硬化症PSS（局限型） 进行性系统硬化症PSS（弥漫型） 类风湿性关节炎RA 多发性肌炎、皮肌炎PM/DM 混合结缔组织病MCTD Ⅱ型自身免疫性肝炎 Ⅰ型自身免疫性肝炎 原发性胆汁性肝硬化PBC
粒细胞等浸润
8. 免疫抑制剂治疗可取得一定疗效
自身免疫性疾病的发病机制
1、遗传因素 2、环境因素 感染、药物、过敏原、压力 3、自身抗原
遗传因素
自身免疫性疾病常有家族遗传倾向。
重症肌无力、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病 类风湿性关节炎、寻常性天庖疮、桥本氏甲状腺炎 强直性脊柱炎
自身抗原
1、 隐蔽抗原的释放 2、 抗原引发的交叉反应
抗ENA抗体的临床意义
3、抗SSA和抗SSB： SS患者最常见自身抗体，抗SSA和抗SSB其阳性检出率分别是70％-80％ 和40％，抗SSB的特异性高于抗SSA抗体，可达50％-60％。两个抗体的 同时检测可提高对SS的诊断率 4、抗Jo—1抗体 抗体最常见于多发性肌炎(polymyositis，PM)，故又称为PM-1抗体。阳 性检出率50％-80％。 5、抗Scl-70抗体 抗Scl-70抗体几乎仅在进行性系统性硬皮病(PSS)，是PSS的特征抗体， 在PSS的阳性检出率为40％-60％。
3、 自身成分的改变
自身抗原
1、 隐蔽抗原的释放
隐蔽抗原是指体内某些组织成分（精子、眼内
容物、脑等），一旦手术、外伤、感染等原因破 坏隔绝屏障，免疫系统将其误识为“异物”，引 发自身免疫应答，导致自身免疫病的发生。
自身抗原
2、共同抗原引发的交叉反应
某些细菌、病毒与正常人体组织细胞上有相 类似的抗原决定簇。如大肠杆菌O:14与人肠 粘膜有嗜异性抗原。 针对这些细菌、病毒抗原决定簇产生的自身 抗体和致敏淋巴细胞可与自身组织细胞发生 交叉反应，引起自身免疫性疾病。
抗双链DNA抗体
• 抗dsDNA抗体是SLE患者的特征性标志抗体。 在SLE的发病机制中起重要作用，SLE并发的 狼疮性肾炎是由该抗体介导的免疫复合物病， 抗dsDNA抗体可形成多种冷沉淀而致血管炎， SLE肾炎及典型的蝶形红斑均与该抗体有关。 抗体滴度与疾病的活动程度呈相关性，动态 测定为观察疗效提供了重要依据。

ANA无器官特异性和种属特异性； ANA主要存在于血清中；
抗核抗体（ANA）检测方法
• 检测方法：目前最常用间接免疫荧光法 （IIF)作为总的ANA筛选试验，IIF检测 在过去最常用小鼠肝细胞印片作为抗原， 现在最常用的是猴肝片和核质丰富的培 养细胞 HEp-2细胞作为抗原。在荧光显 微镜下观察抗原片上ANA荧光着染强度和 免疫荧光图形。
抗Sm 抗SSA 抗Jo-1 抗rib-P蛋白 抗U1-RNP 抗SSB 抗Scl-70
抗ENA抗体的检测与应用
• 抗ENA抗体谱的方法较多，早期 常用的方法有双向免疫扩散 (ID)、对流免疫电 (CIE)，但 敏感度和特异性较低。 • 目前临床检测最常用的方法有 免疫印迹技术(IBT)和斑点酶免 疫技术(dot-ELISA)。
按疾病累及的系统区分
结缔组织疾病 消化系统疾病 生殖系统疾病 神经肌肉疾病 泌尿系统疾病 皮肤组织疾病 内分泌性疾病 血液系统疾病 循环系统疾病
按器官特异性分为两类
系统性自身免疫病 (systemic autoimmune disease)或器官非特异性或全身性自身免疫病 器官特异性自身免疫病 (organ-specific autoimmune disease)或局限性自身免疫病
自身抗体研究发展简史
1948年 Haragraves等发现 LE 细胞现象 1957年 Holborow等应用IIF检测ANA 1961年 Beck等发现ANA不同荧光染色模型 60–70年代 80-90年代 新的自身抗体不断发现 1979年 应用免疫印迹技术检测自身抗体 蛋白多肽水平认识自身抗原
自身抗体的特性
自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体（谱）
是自身免疫性疾病的重要标志
与疾病的活动性相关 参与免疫病理性损伤。
自身抗体的临床意义
AID诊断与鉴别诊断
AID 病情评估与治疗监测
AID病程转归与预后判断 AID致病机制的研究
常检测的自身抗体
• • • • • • • 抗核抗体（ANA） 抗可提取性核抗原抗体（ENA） 抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA） 类风湿因子（RF） 抗角蛋白抗体（AKA） 抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体） 抗心磷脂抗体（ACLA）
抗核抗体（ANA）的检测与应用
ANA阳性者应进一步检测相关抗体以明确诊断
间接免疫荧光法 （indirect immunofluorescence, IIF ）
酶免疫斑点法
ELISA
（Western-blot）
免疫印迹法
ANA荧光类型
均质型
核仁型
斑点型
着丝点型
抗核抗体（ANA）的检测与应用
• 抗核抗体
SLE标志抗体
原发性胆汁性肝硬化标志抗体
免疫印迹技术(immunoblotting)
• 属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗 原的硝酸纤膜。 • 是从小牛或兔胸腺提取的ENA抗原，经SDS—聚丙 烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)，按分子量大小分 离成区带。 • 将各抗原区带转印至硝酸纤维膜上制成抗原吸附 载体膜。 • 将待检血清加在已切成细条的硝酸纤维膜上，待 检血清中存在的抗ENA抗体分别与硝酸纤维膜上 的相应抗原区带结合，当再加入酶标记抗人IgG 抗体后形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物， • 再加入酶的底物，出现显色反应，
抗核抗体（ANA）的检测与应用
常见几种疾病时ＡＮＡ的检出率
疾病
类风湿性关节炎 系统性红斑狼疮 干燥综合征 硬皮病 皮肌炎 混合性结缔组织疾病
阳性率
79％ 50％ 85％ 80％ 80％
86％
ANA检测的临床意义
• ANA可见于多种自身免疫性疾病，特别是结缔组织疾病，常 作为结缔组织病的诊断、病情判断和疗效观察的指标 • 在非结缔组织病中也可出现阳性。 • 正常人中（特别是老年人）也可出现阳性，但滴度低，并且 常表现为IgM型 • ANA阳性并不一定患有自身免疫性疾病 • 目前，ANA检测已成为临床上的一个极重要的自身免疫病的 筛查实验。
• 由于人类对AID 认识的提高，加之临床经验的积 累和实验室诊断技术的进步，AID 发病率明显上 升，其总体发病率占世界人口的3%-5%。
自身免疫性疾病



自身免疫耐受（autoimmune-tolerance）:正常 情况下，机体免疫系统能识别“自我”，对自 身组织成分不发生免疫应答反应，或仅产生微 弱的免疫应答，此为自身免疫耐受。 自身免疫(autoimmunity):是指机体免疫系统针 对自身成分发生免疫应答反应，出现自身抗体 或致敏淋巴细胞的现象。 自身抗体(autoantibody):针对自身组织器官、 细胞及细胞内成分产生的免疫球蛋白（抗体）。
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抗ENA抗体的临床意义
1、抗Sm抗体 SLE的标志性抗体，30%--40%SLE患者抗 Sm抗体 阳性，不与SLE的活动性有关。抗Sm 抗体 对早期、不典型的SLE诊断意义较大。
2.抗核RNP(nRNP)抗体 MCTD的重要血清学依据，检出率大 于95%，活动期或缓解期抗核 RNP抗体 可持续存在。其他自身免疫性疾病有低 滴度的抗核RNP抗体存在。
自身免疫性疾病的共同特征
1. 多数病因不明
2. 患者以女性居多，并随年龄增加发病率有 所增加 3. 有遗传倾向
4. 患者血清中有多种自身抗体或自身反应性 致敏淋巴细胞存在
自身免疫性疾病的共同特征
5. 疾病有重叠现象，即一个病人可同时患一
种以上自身免疫病
6. 病程一般较长，多迁延为慢性
7. 病损局部可发现淋巴细胞、浆细胞、中性
来自百度文库
自身抗体的分类
4、疾病非特异性自身抗体：此类自身抗体可在 多种AID中出现，不具疾病诊断特异性，如抗 核抗体（ANA），可见于多种结缔组织病 5、生理性自身抗体：在正常人中常存在针对自 身抗原的自身抗体，此类自身抗体效价低，不 足以引起自身组织的破坏，但可协助清除衰老 蜕变的自身成分，起免疫自稳效应，其出现的 频率和滴度随年龄增长而增高，常见的自身抗 体有抗核抗体（ANA）、类风湿因子RF
抗dsDNA抗体
SLE特异性抗体，与病情活动度相关。
抗ENA抗体的检测与应用
抗ENA抗体:ENA(extractable nuclear antigens)
是可提取核抗原的总称，ENA抗原可用盐水或磷酸 盐缓冲液从细胞核中被提取。抗ENA抗体是可提取 核抗原抗体的总称。 临床常检测的抗ENA抗体谱主要包括：