出口活鱼中泰妙菌素检验规程编制说明

《出口活鱼中泰妙菌素检验规程》编制说明
、项目概况
依据国家认监委《关于下达 2010 年出入境检验检疫行业标准制 （修）订计划
项目的通知》（国认科函〔 2010〕88 号）文件要求，由徐州出入境检验检疫局承
担《出口活鱼泰妙菌素检测技术规范》标准的制定工作，任务编号 二、编制依据
本标准是按照 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和 编写的规则》、GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》和 行业标准
SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标 准编写的基本规定》的要求编写的。

三、研究的背景
泰妙菌素 （ Tiamulin ） 又名泰妙灵和支原净 , 是由高等真菌担子菌侧耳属
Pleurotus mutilus 和Pleuros passeckerianuu 菌种的深层培养液提取的截短侧耳素
（ Pleuromutilin ） 的氢化延胡索酸盐 , 是双萜烯化合物半合成的抗生素。

由于泰妙 菌素对支原体最具活性 , 是治疗畜禽支原体疾病的首选药物 , 对黄色葡萄球菌、 链球菌等有很强的抗菌活性 , 并对部分弯曲杆菌、螺旋体、真菌、球虫等有很强 的制作用, 因此作为兽药和饲料添
加剂而被广泛应用，尤其是对猪痢疾、猪腹泻 及霉形体肺炎具有优异的治疗及预防效果, 因此作为兽药和饲料添加剂而被广泛 应用。

但泰妙菌素残留可能对人类健康造成严重潜在危害 , 如可能带来大肠杆菌 菌群失调和结肠炎的危险 , 与莫能菌素、盐霉素等聚醚类抗生素合应用时 , 可导
致中毒, 甚至死亡。

因此，世界各国针对动物组织及相关产品中的泰妙菌素残留
g/kg.b.w/d,在猪体内组织的最高残留限量（MRLs ）:肌肉100卩g/kg,肝500卩g/kg .
由于肾脏、 脂肪和皮肤中残留浓度低, 所以没有制定其最大残留限量标准。

日本 农林渔业部对动物肝脏、脂肪、肌肉组织中泰妙菌素的最高残留限量为
mg/kg 。

2010年3月26日，韩国农林水产食品部调整发布了
2010年进口水产品
检验检疫项目,对进口水产品新增检测泰妙菌素、吡喹酮、组胺等项目及品种
15 个。

我国活鱼出口市场主要集中在日本、韩国等东南亚国家。

因此为了有效 控制泰妙菌素的
安全使用, 保障产品的食用安全及打破国外技术壁垒, 保障产品 的顺利出口，有必要建立动物源性食品中泰妙菌素残留量的检测标准及方法。

目前有关泰妙菌素检测技术主要有气相色谱法 (GC) 、高效液相色谱法
(HPLC)和高效液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)法。

GC 法需要衍生化，操作 复杂；液相
色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)准确度和灵敏度高，为各种兽药残留的 确证方法，但设备昂贵、操作要求高、一般基层单位不具备。

因此本方法参照采 用国内外有关文献为基础， 经研究、
2010B019。

量作出了严格的限定。

我国农业部规定了泰妙菌素的
ADI （日许量）为0~30卩
0.04-6
优化和验证后制定，采用高效液相色谱对鱼肉中泰妙菌素的残留量进行检测，考察了前处理
条件和仪器测定参数，旨在建立一种高效、快捷的方法来同时检测满足出口活鱼检测的要求。

四、方法概述
本标准选择了具有代表性的出口鲫鱼、鲈鱼、鮰鱼等活鱼进行研究，经过净化方法优化，液相色谱测定条件试验，选择用PBS 缓冲液和乙酸乙酯混合提取，,
提取物加石油醚除脂，用HLB柱SPE小柱净化,经C18色谱柱分离，通过淋洗
去除柱上杂质，将目标物分离下来，氮吹后定容。

高效液相色谱测定，外标法定量，适用于活鱼中可食组织中残留量的检测。

本方法经回收率试验，精密度试验，方法验证试验。

结果表明，各项技术指标均完全满足检测需要。

五、实验方法论证情况
5.1 提取和净化条件
根据文献报道，根据泰妙菌素的理化性质，加入pH8.0 的磷酸盐缓冲液将延胡索酸泰妙菌素转换成分子态，再选择有机溶剂将目标物提取出来。

分别使用乙酸乙酯和丙酮作为提取液，比较提取效果，结果表明，乙酸乙酯的提取效果较好，提取杂质少，可有效的避免了基质干扰。

采用石油醚能去除样品溶液中的脂肪等杂质，初步净化效果较好。

根据延胡索酸泰妙菌素有大分子的官能团，通过
Oasis HLB柱进行样品净化和富集，可取得良好的净化效果。

在优化提取条件时，采用向鱼肉中添加浓度为0.5 mg/kg 的泰妙菌素，分别用上述方法分一次、两次和三次提取，回收率依次为76.8%、90.5% 和92.7%，因此选择分两次提取，提取液分别为30mL 、20mL 。

5.2 液相色谱分析条件的确定
5.2.1 色谱柱选择
选择常用的岛津0DS-3 型C18 (250 mm K 4.6 mm, 5^m)柱、Agile nt zorbax XDB C18 (250 mmX4.6 mm, 5 ^m)柱，均可以使待测物组分在较短的时间内实现最大程度的有效分离。

5.2.2 检测波长的确定
标准品通过DAD 检测器三维图谱扫描，可看到，延胡索酸泰妙菌素在210nm
处有最大吸收，因此选择210nm 作为检测波长。

5.2.3流动相的选择
根据参考文献，流动相有甲醇-乙腈-碳酸铵、甲醇-庚烷磺酸钠离子对试剂法、
甲醇-乙腈-磷酸二氢钾等。

对以上条件进行了筛选，结果表明，离子对试剂及含盐的流动相基线平衡时间较长，基线不稳且响应值一般，对柱子损伤较大。

使用乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水体系，峰形均较好，不仅能将待测物很好地
分离出来，不受杂峰的干扰，但乙腈：0.1%磷酸体系出峰时间较早，而甲醇：0.1% 磷酸水(v:v=10:90)出峰时间较适中，峰宽、峰形等定量条件较好，无拖尾, 以此作为流动相条件。

5.2.4 定量方式
采用外标法定量，以校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。

保留时间为7.2min。

535线性范围及定量限
0.2、0.5、0.8、1.5、2.0mg/L 的泰妙菌素标准工作液 进行分析。

结果表明，在此浓度范围内，泰妙菌素色谱峰面积与浓度呈线性相关, 其线性回归方程为：丫=7.0727X-0.2253，r=0.9989，符合定量要求。

泰妙菌素添加0.1mg/kg 时，其信噪比均大于10，获得较好的回收率及精密 度，由此确定本标准泰妙菌素的检测低限为
0.05mg/kg 。

5.3.6方法的回收率和精密度
在上述色谱条件下，对 a era
百
d
图1标准溶液HPLC 色谱图
表1延胡索酸泰妙菌素标准曲线
y = 7.0727X - 0.2253
C(mg/L)
O
8 6 4 O 4 2 O 2
用阴性鱼肉样品做添加回收和精密度实验，考察方法的准确度和重现性。

样
品添加不同浓度标准后，按本方法进行提取、净化和测定，每个水平添加5个样品，测定3个批次。

泰妙菌素添加量均为0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg水
平的标准溶液，其平均回收率及相对标准偏差见表1。

从表中看出，三个添加水
平回收率在73.8%~103.1 %之间，批内相对标准偏差在4.7%~8.5%之间，方法的
回收率和精密度良好。

图3空白鲫鱼样品色谱图
图4鲫鱼加标样品色谱图
图6鲈鱼加标样品色谱图
(T AJ 2D- 15- 10 图5空白鲈鱼样品色谱图
寸
m
4 8
n M J
10 图7 空白斑点叉尾鮰样品色谱图
3.3.5方法回收率和精密度
样品
添加量
（mg/kg
）
测定批次
平均回收率
（%，n=5）
批内相对标准偏差
（%）
批间相对标准偏差
（%）
鲫鱼0.05
178.98.5
7.4
275.67.4
374.2 6.4
0.1
181.5 5.6
6.1
278.6 5.1
378.97.5
0.2
193.1 6.4
5.9
298.5 6.1
3103.1 5.2
鲈鱼0.05
178.3 6.5
7.1
275.87.9
377.1 6.8
0.1
178.6 6.5
6.3
283.37.6
386.9 4.9
0.2
188.5 5.9
5.6
291.9 6.1
385.6 4.7
斑点叉尾
鮰0.05
179.6 6.1
6.8
275.2 6.6
373.87.8
0.1
178.8 6.8
7.0
279.17.5
382.4 6.6
0.2
190.6 6.1
6.4
287.8 5.9
394.47.3
49
斑点叉尾鮰加标样品色谱图
N
F
N
N
J
【一-
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