实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质

一、实验目的

1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理

马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶

邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O

2——————→邻醌＋H

2

O

三、试验材料、试剂及试验用品

1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶

3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠

四、实验方法：

1.多酚氧化酶的提取

取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

2.多酚氧化酶活性测定

采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。

表1 多酚氧化酶活性测定

3.多酚氧化酶酶活的计算公式：

以每克样每分钟内A410增加为1个酶活力单位U。

△A410×酶提取液总量（ml）

酶活力（g min）＝———————————————————

×反应时间(min)×样品鲜重(g)×测定时酶液用量(ml)

4 酶学特性

PH对多酚氧化酶活性的影响

室温下在试管中加入已配好的不同pH值的缓冲溶液，邻苯二酚，多酚氧化酶粗酶液mL，混匀后迅速测定吸光度，转换为多酚氧化酶的活性。以缓冲液pH值为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活—pH曲线，以确定最适pH值。

表2 pH对多酚氧化酶活性的影响

温度对多酚氧化酶活性的影响

试管中加入pH 的磷酸盐缓冲溶液, 以邻苯二酚溶液为底物,在不同温度（常温、40、60℃的温度条件)下保温5min后，加入多酚氧化酶粗酶液，混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以温度为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活—温度曲线，以确定最适温度。

表3 温度对多酚氧化酶活性的影响

抑制剂对多酚氧化酶活性的影响

将抑制剂抗坏血酸（VC）、柠檬酸、亚硫酸钠、EDTA分别用的磷酸盐缓冲溶液配制成10mmol/L的溶液，在室温下分别取上述抑制剂，以邻苯二酚溶液为底物，加入多酚氧化酶粗酶液，混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以抑制类型为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，绘制抑制剂对酶活影响的图形，分析抑制剂对酶活性影响。

表4抑制剂对多酚氧化酶活性的影响

五、注意事项

1、反应混合液必须现配现用，否则会因邻苯二酚自动氧化而失效；

2、在试验中加入一种酚结合剂--聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），它能与酚类化合物强烈地发生缔合作用，从而消去酶反应体系中的底物，使 PPO活性的测定更接近其真值。

3、使用分光光度计时要求动作快速、熟练。

4、加样时，先加缓冲溶液，再加底物邻苯二酚，摇匀，在测量之前最后加酶提取液。

六、思考题

1. 本试验中使用到磷酸缓冲液，请问磷酸缓冲液在本试验中的作用

2. 试分析不同温度、pH对马铃薯多酚氧化酶的影响

3. 谈谈你对多酚氧化酶活性性质的认识。

参考文献：

曹建康，姜微波，赵玉梅编着.果蔬采后生理生化实验指导.中国轻工业出版社,.

毛丽梅，邓红，马安德，卢晓翠。食品安全综合实习指导.科学出版社,.

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李彩霞张芬琴张喜峰赵金梅白生文