鸡胚原代细胞培养

鸡胚原代细胞培养
细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。

在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。

要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。

组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。

组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。

很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。

细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。

组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。

原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。

本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。

（一）实验目的
了解单层细胞培养方法
（二）实验材料
1、10日龄鸡胚。

2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。

3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。

（三）实验方法
1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。

以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。

2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。

３、用镊子将组织块放入无菌三角烧瓶内，加入１０～１５ml0.25液，37?水溶浴20分钟，中
间摇动几次，由于胰酶的作用可使大量的细胞游离，液体变混，经四层纱布过滤后的细胞悬液，低速离心沉淀（1000转/分钟以内），5分钟，吸上去清液，再用Hanks氏溶液洗一次，沉淀物加入适量营养液，用白细胞计数的方法进行计数，使成每毫升含50～８０万细胞的细胞悬液。

４、每一组织培养瓶，注入细胞悬液1ml，盖好瓶塞，并将瓶略加动摇，横卧于有槽木架上，使细胞均匀平铺于瓶壁，置37?温箱孵育，一般4小时，细胞即已附着于瓶壁，48小时已长成单层，此时即可弃去营养液，单层用Hanks氏溶液洗2次（以除去营养液中血清所含的病毒制物），接种病毒，换以维持液。

（四）实验结果
培养48小时后长成单层，镜下可见瓶壁上有一层梭形活细胞，排列紧密，互相之间呈嵌合状，细胞外观透明，有一圆形核。

（五）注意事项
1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。

细胞计数可在有菌环境中进行。

2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。

（六）无菌操作的几个注意事项
1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。

试剂等瓶口也要擦试。

2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

6、吸溶液的吸管等不能混用。

细胞培养的一般过程
一、准备工作
准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。

准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

二、取材
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。

如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。

机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。

取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。

取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。

三、培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。

如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。

如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。

细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。

过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。

细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。

每传代一次称为“一代”。

二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。

转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。

培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

四、冻存及复苏
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。

冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。

在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。

复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。

然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。