蛋白表达系统的选择
列举常用的蛋白质表达系统并阐述其基本表达策略
常用的蛋白质表达系统及其基本表达策略1. 介绍蛋白质表达系统是在生物技术领域中广泛应用的重要技术，它可以在大量生产目的蛋白质时提供帮助。
在选择蛋白质表达系统时，科研人员通常需要考虑表达效率、纯度、可溶性和最终产物活性等因素。
在本文中，我们将介绍一些常用的蛋白质表达系统，并阐述它们的基本表达策略。
2. 细菌表达系统细菌表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一，其中大肠杆菌表达系统是应用最为广泛的。
基本表达策略包括将目的基因插入原核表达载体中，通过大肠杆菌的代谢系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、选择合适的宿主菌株以及优化表达条件等因素。
3. 酵母表达系统酵母表达系统通常采用酿酒酵母或毕赤酵母。
基本表达策略包括将目的基因插入酵母表达载体中，通过酵母的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择合适的启动子、选择适当的宿主菌株以及与酵母细胞适应的表达条件等因素。
4. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统常用于大规模生产蛋白质。
基本表达策略包括将目的基因插入昆虫表达载体中，通过昆虫细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择合适的启动子、适当的宿主昆虫细胞系以及适合昆虫细胞生长的表达条件等因素。
5. 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统通常用于生产高度活性的蛋白质。
基本表达策略包括将目的基因插入哺乳动物表达载体中，通过哺乳动物细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、选择适合的宿主细胞系以及适合哺乳动物细胞生长的表达条件等因素。
6. 植物细胞表达系统植物细胞表达系统是一种新兴的蛋白质表达系统，常用于农业生物技术和药物开发领域。
基本表达策略包括将目的基因插入植物表达载体中，通过植物细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、适合的宿主植物组织以及适合植物细胞生长的表达条件等因素。
结论在选择蛋白质表达系统时，科研人员需要根据目的蛋白质的性质、表达需求以及实验条件等因素综合考虑，并选择最适合的表达系统和基本表达策略。
不同表达系统在蛋白质产生方面的优缺点
不同表达系统在蛋白质产生方面的优缺点随着科技的日益发展，人们对于生物学研究的需求也越来越高。
而蛋白质作为生命体代谢过程中的重要组成部分，其产生机制的研究也变得越来越重要。
不同的表达系统在蛋白质产生方面有着不同的优缺点，本文将从多个方面进行分析。
一、概述蛋白质表达是指将 DNA 序列转录为 RNA 后再将其翻译为相应的蛋白质的过程。
在这个过程中，表达系统起到了至关重要的作用。
不同表达系统的优缺点直接影响了蛋白质的产率和质量。
二、大肠杆菌表达系统大肠杆菌系统是最常用的表达系统之一。
其最大的优点是表达量高，结构简单且易于操作。
此外，大肠杆菌表达系统还具有以下优点：1. 成本低廉：大肠杆菌的培养和酵母细胞相比较简单，生产成本相对较低。
2. 短周期：大肠杆菌表达系统的周期短，能够较快产生大量的蛋白质。
3. 稳定性高：大肠杆菌表达系统非常稳定，可以长期保存和传代。
但是，大肠杆菌表达系统也存在一些缺点：1. 没有真核系统那样完善的修饰功能：大肠杆菌表达的蛋白质无法进行真核系统所特有的复杂后修饰。
2. 易受到毒素的影响：表达的蛋白质会容易受到毒素、有害物质的影响。
三、哺乳动物系统表达系统哺乳动物系统表达系统可以表达具有多种复杂后翻译修饰的蛋白质，这些蛋白质更接近自然状态，因此常用于生产生物药物、抗体的制备。
哺乳动物系统表达系统相较其他表达系统的优点包括：1. 复杂修饰：哺乳动物系统表达的蛋白质可以被修饰成比较接近自然状态的蛋白质。
2. 有利于生产生物药：哺乳动物系统表达的蛋白质可以用于生产许多生物药。
但是，哺乳动物系统表达不是没有缺点，主要包括：1. 成本高：哺乳动物系统表达的成本比其他表达系统高。
2. 周期长：哺乳动物表达系统周期长，需要更长时间才能产生足够的蛋白质。
四、昆虫系统表达系统昆虫系统表达是近年来发展起来的新一代表达系统。
这种表达系统的优点主要有：1. 微生物介导不良反应少：由于昆虫细胞培养液比微生物培养液更接近人体环境，所以由昆虫细胞表达的蛋白质导致的过敏反应很少。
生物制药中的表达系统选择和使用注意事项
生物制药中的表达系统选择和使用注意事项生物制药是一项利用生物学原理和技术来生产药物的领域，其中表达系统的选择和使用是至关重要的步骤。
表达系统是指将目标基因转录成mRNA并翻译成蛋白质的系统，它直接关系到生物制药中药物产量、质量和效力等方面。
在选择和使用表达系统时，需要考虑多种因素，包括目标蛋白的性质、产量要求、系统稳定性和成本效益等。
首先，选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质。
不同的蛋白质具有不同的结构和功能，因此需要根据目标蛋白是否是酶、激素、抗体等来选择合适的表达系统。
例如，如果目标蛋白是细胞内酶，可以考虑使用大肠杆菌表达系统，因为大肠杆菌对这类蛋白的表达效果较好。
而如果目标蛋白是复杂的膜蛋白，可以考虑使用哺乳动物细胞表达系统，因为哺乳动物细胞具有更接近人体细胞的表达环境。
其次，生物制药中的表达系统选择还需考虑产量要求。
不同的表达系统对蛋白质的表达能力有所差异，选择合适的表达系统可以提高蛋白质的产量。
例如，选择细胞系表达系统时，可以选择具有高复制和表达能力的细胞系，如CHO细胞。
此外，一些表达系统还可以通过基因工程技术增加蛋白质的产量。
例如，可以通过插入多个目标基因拷贝、优化启动子序列和信使RNA的稳定性等方式来提高表达系统的产量。
同时，选择表达系统还需要考虑系统的稳定性。
所谓稳定性指的是表达系统能否持续稳定地表达目标蛋白。
在生物制药中，长时间和稳定的表达对于大规模生产药物至关重要。
因此，选择具有稳定表达能力的表达系统非常重要。
例如，大肠杆菌表达系统常常因为由于毒力基因的表达而导致大规模突变，从而降低了系统的稳定性。
而哺乳动物细胞表达系统，虽然表达系统稳定性较高，但细胞系的稳定性会受到外界环境的影响。
此外，成本效益也是选择表达系统时需要考虑的因素。
不同的表达系统所需的设备、耗材和操作成本都不同。
因此，在选择表达系统时，需要综合考虑产量要求和成本效益。
对于小规模生产或科研用途而言，大肠杆菌表达系统通常是较为经济的选择；而对于大规模生产企业而言，哺乳动物细胞表达系统可能更具成本效益。
蛋白质可溶性的调控与表达系统的选择
蛋白质可溶性的调控与表达系统的选择蛋白质是生命体中非常重要的一种分子，它们参与了细胞代谢的各个环节，并扮演着结构、信号传递、酶催化等多种重要角色。
在生物制药、基因工程等领域，大量需要生产蛋白质的需求，因此如何实现高效、高产、高纯度的蛋白质制备成为了很多人关注的话题。
蛋白质的可溶性是影响表达量的重要因素之一。
在表达载体中，蛋白质的可溶性受到多种因素的影响，包括蛋白质序列特性、温度、离子强度、pH、氧气含量、分泌效率等等。
若蛋白质处于不可溶性状态，不能在细胞内成功表达，无法用于下游纯化的需求，因此如何实现蛋白质的高度可溶性成为了一项非常有挑战性的任务。
为了提高蛋白质的表达效率及可溶性，人们进行了多种策略的研究。
其中如何选择适合的表达系统成为了一个重要的问题。
在基因工程领域，常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等等。
大肠杆菌是最常被使用的表达系统之一，因为其生长速度快、培养条件容易掌控、生产成本低、存储条件简单等优点。
不过，大肠杆菌的表达质量常常受到多种因素的影响。
一方面，由于培养条件不可避免地会造成蛋白质聚集和沉淀，因此大肠杆菌表达的蛋白质的可溶性常常较低。
为了解决这个问题，人们通常会选择使用特殊的大肠杆菌突变体，在其内部表达具有较高可溶性标签的蛋白质。
或者也可以在大肠杆菌表达完毕后使用特殊的离子交换介质等来进行可溶性的提升。
另一方面，传统的大肠杆菌表达系统往往难以表达复杂的蛋白质。
复杂蛋白质序列含有大量的游离硫酸氨基酸、脱氨基酸较多等特殊结构，使得其表达难度很高。
因此，一些新的大肠杆菌表达系统如T7表达系统、双RNA多样性补体表达载体等的诞生大大缓解了这个问题。
酵母菌在表达可溶性蛋白质方面也表现出了很高的潜力。
酵母菌表达系统包括酿酒酵母和毕赤酵母。
其中毕赤酵母表达系统因为能耐高温、高pH、高盐等多种恶劣环境而受到人们的青睐。
另外，毕赤酵母表达谷氨酰胺合成酶、重组十六烷酰体素生合成酶、融合菌糖神经酰胺合成酶等多种复杂重要酶的记录表现出出色的表达效果。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点蛋白质表达是生物学研究中一项重要的技术，它可以通过合成蛋白质来研究其结构和功能。
蛋白质表达系统是实现这一过程的关键工具，主要包括原核表达系统和真核表达系统两种。
本文将对这两种蛋白质表达系统进行介绍，并分析它们的优缺点。
一、原核表达系统原核表达系统是利用原核生物（如大肠杆菌）来表达外源蛋白质的系统。
该系统具有以下特点：1. 高表达水平：大肠杆菌是常用的原核表达宿主，具有高表达水平的优势。
通过利用原核细胞的强大蛋白质合成机器，可以获得高产量的外源蛋白质。
2. 易操作性：原核表达系统相对简单，操作步骤少，易于操作和控制。
不需要复杂的细胞培养条件，可以在常见培养基中进行表达。
3. 快速表达：从启动表达到获得蛋白质通常只需要数小时至数天，速度较快。
这使得原核表达系统在高通量表达和快速实验中具有优势。
然而，原核表达系统也存在一些缺点：1. 外源蛋白质折叠问题：由于原核细胞的机器无法正确折叠某些复杂蛋白质，这可能导致外源蛋白质的不正确折叠和失活。
2. 原核特异性翻译后修饰：原核细胞缺乏一些真核细胞所具有的翻译后修饰机制，这可能影响蛋白质的功能和稳定性。
3. 复杂蛋白质表达困难：对于复杂蛋白质（如膜蛋白），原核表达系统通常无法达到理想的表达水平和正确的折叠结构。
二、真核表达系统真核表达系统主要利用真核生物（如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）来表达外源蛋白质。
真核表达系统具有以下特点：1. 正确的折叠和修饰：真核细胞具有复杂的蛋白质折叠和修饰机制，能够产生正确折叠和修饰的蛋白质。
2. 适用于复杂蛋白质：真核表达系统适用于复杂蛋白质（如膜蛋白）的表达。
真核细胞提供了正确的环境和细胞器，能够较好地表达这类蛋白质。
3. 适用于大规模表达：真核细胞通常可以进行大规模培养和表达，适用于工业化生产。
然而，真核表达系统也存在一些缺点：1. 低表达水平：相对于原核表达系统，真核表达系统的表达水平较低，可能无法满足高产量蛋白质的需求。
重组蛋白的制备与应用
重组蛋白的制备与应用重组蛋白是一类通过基因工程技术制备出来的在生物体外表达的蛋白质物质，其制备过程包括三个主要步骤：基因改造、载体构建和表达系统选择。
使用这种技术可以获得各种高效、高产、高纯度的蛋白质，其应用广泛，例如制药、生物技术、生物学研究等领域。
一、基因改造基因改造是制备重组蛋白的第一步。
由于自然界中很多生物的蛋白质并不能满足人类的需求，因此必须对其基因进行改造以改变蛋白质的结构和性能。
常见的基因改造技术包括反转录PCR、酶切法、打靶法等等。
这些技术的原理是依据DNA的复制和重新组合原理，通过扩增、切割和拼接DNA分子来改变基因序列。
基因改造的成功关键在于构建基因合适的载体。
载体是用来承载目标基因，从而实现其表达的一种DNA分子，常见的载体包括质粒、噬菌体等。
不同的载体具有不同的优点，在选择载体时需要根据目标基因所需的表达强度、稳定性和是否存在毒性等因素进行综合考虑。
二、载体构建载体是将目标基因导入宿主细胞内进行表达所需要的工具。
载体构建是制备重组蛋白的第二步。
载体的构建通常包括：目标基因的克隆、检测和定向插入等步骤，这些步骤构成了载体构建的关键环节。
在目标基因的克隆过程中，需要对其进行的多个PCR扩增和多个限制性内切酶切割和定向克隆。
因为该过程涉及到许多不同的关键步骤，如果操作不当，将会导致载体构建的失败。
三、表达系统选择表达系统是实现基因表达的系统，是制备重组蛋白的最后一个关键环节。
表达系统的选择必须考虑到目标蛋白的需求和表达目的。
常用的表达系统有：细胞表达系统、水相体系、脂质体、真核和原核表达系统等。
真核表达系统通常适用于较大的重组蛋白以及需要进行修饰的蛋白质，该系统其他优势可能还有较低的真核细胞毒性，转化效率高，能够表达高度复杂的蛋白等。
原核表达系统可以使用大肠杆菌或是其他的真核细胞外原核性微生物表达基因。
由于大肠杆菌是一种常见的微生物，所以原核表达系统被广泛地应用于重组蛋白的表达中。
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4：常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和白不表达时：
2
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在pH9.0下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。
蛋白表达纯化的实验原理
蛋白表达纯化的实验原理蛋白表达与纯化是生物学实验中常用的技术，可以用来研究和生产各种蛋白质。
本文将一步一步回答关于蛋白表达纯化实验的原理和步骤。
第一步：蛋白表达系统的选择蛋白表达系统是指用来制备和表达目标蛋白质的细胞或病毒载体。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。
选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质、需求量和表达效率等因素。
第二步：构建表达载体表达载体是将目标蛋白的基因序列插入到细胞或病毒载体中，以实现蛋白表达的工具。
通常采用的方法是将目标基因通过限制性内切酶切割，然后与适当的载体连接。
第三步：细胞转染或感染将构建好的表达载体转染到细胞中，使目标蛋白基因在细胞内进行表达。
对于真核细胞（如哺乳动物细胞）可以通过转染的方式传递质粒DNA，而对于原核细胞（如大肠杆菌）可以通过热激转化或电穿孔等方法进行具体的转染。
第四步：培养表达细胞转染或感染后，需要将细胞培养到合适的条件下，以促进目标蛋白表达。
培养条件包括适宜的培养基、温度、氧气供应和营养物等。
此外，可以考虑添加特定的诱导剂或抑制剂，以调控蛋白表达的级别。
对于细菌目标蛋白表达，通常将细胞培养在含有抗生素的培养基上以选择表达带有目标基因的细菌。
第五步：蛋白表达检测为了确定目标蛋白是否在细胞中表达，可以使用多种方法进行检测。
常用的方法包括Western blot、ELISA、原位杂交、荧光染色等。
同时，可以通过调整培养条件或表达载体的构建来提高蛋白表达的水平。
第六步：蛋白纯化蛋白纯化是从表达系统中提取和纯化目标蛋白的过程。
纯化步骤的选择取决于目标蛋白的性质和所需的纯度。
常见的纯化方法包括亲和纯化、凝胶过滤、离子交换、大小排除层析、亲水性层析等。
此外，还可以使用亲和标签（如His标签、GST标签等）来辅助蛋白质的纯化。
第七步：蛋白质的鉴定和定量通过蛋白纯化后，需要对目标蛋白进行鉴定和定量。
可以使用SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等方法来确定蛋白质的分子量和纯度。
如何选择合适的蛋白表达系统
如何选择合适的蛋白表达系统？金开瑞拥有原核/真核/无细胞等六大重组蛋白表达系统，提供从基因合成到蛋白表达的一站式蛋白服务，并通过表达载体的改造和实验流程的优化，可在最短时间获得最高的产量，满足您的各项需求。
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根据您所需要表达蛋白的特点，可选择合适的表达系统：真核酵母细胞经济高效，放大培养基廉价、培养条件简单、生产迅速、可拓展性强、分泌蛋白或细胞内表达的良好选择、蛋白分泌高效且允许简单纯化、广泛的翻译后修饰、无内毒素工业菌种改良、放大自行改造的高效分泌载体和宿主组合，可在最大程度上实现最高质量的蛋白表达；专利的Biobrick技术，可成功用于工业菌种的改良优化杆状病毒-昆虫细胞基因容量大，外源基因表达效率高，有效的细胞折叠、中度可扩展性、广泛的翻译后修饰、糖基化与哺乳动物细胞类似、相对容易地酶促的去糖基化、无内毒素病毒疫苗、信号蛋白、细胞因子、激酶等采用AcNPV-sf9细胞和BmNPV-BmN细胞两种表达系统，多表达系统、多宿主、多载体的选择性极大的提高了蛋白表达的成功率哺乳动物细胞较高的表达水平、中度的可扩展性、细胞的悬浮培养特性可大规模生产、有效的蛋白折叠、适合分泌蛋白、充分的翻译后修饰、无内毒素复杂高等真核生物蛋白采用特有的哺乳动物细胞表达载体和多种转染方法的组合方式，优化表达条件，提高转染效率，大大缩短实验周期，显著提高表达量。
蛋白质表达的常见问题及其解决办法
蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。
然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。
本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。
一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。
不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。
常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。
找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。
解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。
对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。
对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。
此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。
二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。
在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。
解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。
分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。
此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。
三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。
然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。
解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。
首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。
其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。
此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。
四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。
蛋白质表达系统的选择与优化
蛋白质表达系统的选择与优化蛋白质表达系统是目前生物技术领域非常重要的研究领域，蛋白质的表达可以为生命科学领域、医学领域、工业领域和农业领域等带来许多重要应用。
但是，选择一种合适的蛋白质表达系统对于高质量的蛋白质表达和产量的提高非常重要。
在本文中，我们将介绍蛋白质表达系统的选择和优化，并讨论这些系统的优缺点。
一、蛋白质表达系统的分类蛋白质表达系统是一种将外源性DNA转化为蛋白质的机制。
这些系统可以分为原核细胞和真核细胞表达系统。
1.原核细胞表达系统细菌和真核生物分别是最常用的原核细胞和真核细胞表达系统。
许多细菌都可以被用来表达蛋白质，如大肠杆菌和嗜热菌。
这些细菌具有相对较简单的基因组和代谢网络，其表达蛋白质速度快且较容易操作。
然而，蛋白质的折叠机制、修饰和复合物形成在原核细胞中会受到迫害，因此，一些复杂蛋白质可能是难以表达的。
2. 真核细胞表达系统哺乳动物细胞是最常用于真核细胞表达系统的细胞类型之一。
它们具有许多优点，如复杂和准确的蛋白质折叠和修饰、较高的产量和较小的瘤变率。
然而，哺乳动物细胞培养是昂贵且需要较长的时间来制备蛋白质。
二、蛋白质表达系统的选择在选择蛋白质表达系统时，需要考虑以下几个因素：1. 表达蛋白质的难易程度一些蛋白质难以表达，对于这些蛋白质来说，选择优化的表达系统非常关键。
具有较少修饰的表达系统通常易于操作，但可能不能提供正确的折叠条件。
在这种情况下，需要考虑使用具有更多修饰和折叠机器的系统，如真核细胞表达系统。
2. 蛋白质的规模和产率当需要表达大量蛋白质时，需要选择具有高产量的表达系统。
对于小规模的蛋白质表达，可以使用原核细胞表达系统来最大限度地减少成本和时间。
哺乳动物细胞表达系统可以表达大量蛋白质，但该过程较为复杂，因此不适合小规模表达。
3. 功能性要求对于需要进一步研究或将蛋白质应用于临床医学的情况，需要进行适当的修饰。
在这种情况下，真核细胞表达系统更适合于表达需要糖基化或其他修饰的蛋白质。
蛋白表达体系
蛋白表达体系
蛋白表达体系是指人工制造蛋白质的方法，通常用于生物医学研究、
药物开发和工业生产等领域。
目前常用的蛋白表达体系包括细胞外和
细胞内两种。
细胞外表达体系是指将目标基因转化到真核细胞中，利用其分泌功能
在培养基中大量制造蛋白质。
这种方法适用于大规模生产重组蛋白质，如抗体、酶类等。
常见的细胞外表达系统有CHO、HEK293、Hela等。
细胞内表达体系是指将目标基因转化到原核细胞中，在其内部合成蛋
白质。
这种方法适用于小规模生产复杂的蛋白质，如激素、毒素等。
常见的细胞内表达系统有大肠杆菌（E.coli）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）等。
在选择蛋白表达体系时需要考虑多个因素，如所需量、复杂度、纯度
要求以及成本等。
同时还需要对不同的表达系统进行优化和调节，以
提高其效率和稳定性。
总之，蛋白表达体系是一种重要的生物技术手段，对于推动生物医学
研究和药物开发等领域具有重要意义。
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。
对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
~复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。
表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。
不同蛋白质表达系统的比较
不同蛋白质表达系统的比较蛋白质是细胞内重要的生物大分子，可以发挥许多生命活动的关键作用。
不同的蛋白质表达系统可以用于生产不同类型的蛋白质，比较蛋白质表达系统的优缺点对于选择合适的表达系统具有重要的意义。
本文将介绍现有的几种主要的蛋白质表达系统，并对它们的特点进行比较。
第一种蛋白质表达系统是基于真核细胞的表达系统。
真核细胞是具有细胞核的细胞，其中包括了动物细胞、植物细胞和真菌细胞等。
这种表达系统利用真核细胞的转录和翻译机制来制造目标蛋白质。
在这种系统中，目标基因被插入到真核细胞的基因组中，然后通过RNA剪切和mRNA成熟等机制生成成熟mRNA，从而进行翻译，最终目标蛋白质被产生出来。
真核细胞表达系统的优点包括：能够产生生物活性和功能齐全的蛋白质。
这种系统还适用于产生大量的蛋白质，因此被广泛应用于产生多肽、抗体等药物。
但是，真核细胞表达系统的劣势在于工艺更加复杂，容易出现蛋白质不稳定、失去生物活性的问题。
此外，该工艺需要一定的时间来建立并优化系统。
第二个系统是基于细菌的表达系统。
细菌是单细胞生物，具有非常简单的结构和进化历史，是蛋白质表达方面的主要模型。
在这种表达系统中，表达载体中的目标基因被转化为蛋白质，并通过重组不同的DNA序列来实现该过程。
这种系统的优点在于简单、实时、具有可伸缩性和高效性。
制备蛋白质的成本也相对较低。
然而，这种表达系统的制约因素也很明显。
细菌系统不能表达合成二硫键、表达动力多肽等蛋白质的功能，使其应用领域相对狭窄。
此外，细胞酸碱值和产生蛋白质的环境等因素，都是影响蛋白质表达的关键因素。
第三种蛋白质表达方式是基于哺乳动物细胞的表达系统。
哺乳动物细胞表达系统主要用于大规模制备人用蛋白质。
这种表达系统利用哺乳动物细胞的转录和翻译机制来制造目标蛋白质。
在这种系统中，目标基因经过一系列的转染和筛选过程，被转移到哺乳动物细胞中，利用细胞所提供的设备进行蛋白质合成和修饰。
哺乳动物表达系统具有高表达量、具备更完整的蛋白质修饰等诸多优点。
蛋白质表达系统的选择原核与真核细胞的比较
蛋白质表达系统的选择原核与真核细胞的比较蛋白质表达是生物学研究中至关重要的实验技术之一，它可以帮助科学家们生产大量特定的蛋白质，并且进行进一步的研究。
在进行蛋白质表达时，科学家们可以选择将目标基因表达于原核或真核细胞中。
本文将对原核细胞和真核细胞的差异进行比较，分析选择适合的蛋白质表达系统的几个关键因素。
1. 细胞结构差异原核细胞是没有真核细胞特有的细胞核和复杂的胞器结构的单细胞有核生物。
相比之下，真核细胞的细胞结构更加复杂，包括细胞核、线粒体、内质网等。
这些细胞器的存在使得真核细胞在蛋白质表达过程中能够进行更多的后续修饰和折叠，从而获得更高的蛋白质表达效率。
2. 转录与翻译差异在原核细胞中，DNA转录和蛋白质合成是同时进行的。
因为没有细胞核的隔离作用，转录和翻译可以在细胞质中同时进行。
而在真核细胞中，DNA转录发生在细胞核中，形成的mRNA需要通过核孔复合体进入细胞质，然后才能进行翻译。
这种分离的过程使得真核细胞蛋白质表达的效率相对较低。
3. 后续修饰能力差异真核细胞拥有更强大的后续修饰能力。
在蛋白质合成过程中，真核细胞能够进行糖基化、磷酸化、酰化等修饰作用，从而赋予蛋白质更多的功能和稳定性。
相比之下，原核细胞的后续修饰能力较弱，只能进行有限的修饰。
4. 表达量与成本差异原核细胞的表达系统通常能够提供较高的表达量，因为它们能够在较短的时间内合成大量的蛋白质。
此外，原核细胞的培养成本相对较低，适用于大规模生产。
真核细胞在表达大蛋白质时效率较低，而且培养成本相对较高。
综上所述，选择表达系统需要考虑具体实验要求。
如果需要大量表达，可以选择原核细胞，如大肠杆菌。
原核细胞表达系统的优势在于高表达量和低成本。
而如果需要进行复杂的后续修饰，以及模拟真实细胞环境的蛋白质表达，则可以选择真核细胞，如酵母或哺乳动物细胞。
真核细胞表达系统的优势在于能够进行复杂的蛋白质修饰和得到更接近自然状态的蛋白质。
此外，还可以根据实验需求进一步优化表达系统，例如引入特定的启动子或基因调控元件来提高表达效率和稳定性。
无细胞蛋白表达工艺流程
无细胞蛋白表达工艺流程包括以下步骤：
1. 选择适当的表达系统：常用的无细胞蛋白表达系统包括原核系统（如大肠杆菌）和体外转录/翻译系统（如小鼠巨细胞裂解系统或人类细胞质裂解系统）。
2. 构建表达载体：将目标蛋白的编码序列克隆到适当的表达载体中，通常包括启动子、转录终止子和选择性标记。
3. 转化或转染表达宿主：将构建好的表达载体导入到相应的表达宿主中，如大肠杆菌细胞或体外细胞质裂解系统。
4. 蛋白表达：在适当的培养条件下，促使表达宿主细胞或体外转录/翻译系统表达目标蛋白。
这可能包括调节培养温度、添加诱导剂或调节培养时间等。
5. 细胞裂解：对于表达宿主细胞，通常使用机械方法（如超声波或高压均质器）或化学方法（如溶菌酶或洗涤剂）裂解细胞膜，释放目标蛋白。
对于体外转录/翻译系统，通常通过离心等方法分离蛋白。
6. 纯化目标蛋白：使用各种纯化方法（如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等）纯化目标蛋白。
7. 分析和鉴定：使用各种方法（如SDS-PAGE、Western blot、质谱等）对纯化的蛋白进行分析和鉴定。
8. 储存和使用：将纯化的蛋白适当地储存，以备后续的实验或应用。
需要注意的是，无细胞蛋白表达工艺流程可能因不同的表达系统和目标蛋白的特性而有所差异，上述步骤仅为一般流程。
提高蛋白表达产量的措施
1 表达系统的选择对于一个表达实验，选择何种表达系统应根据实际需要来决定，如表达蛋白的需求量、用途、实验所需时间及对细胞的毒性。
选定表达系统之后，还需考虑表达载体与宿主细胞的合理搭配问题：比如若以BHl/VP16为宿主细胞，则表达载体最好选用HSV早期启动子驱动目的基因的表达，因为该启动子受VP16的转录激活；LCR元件只有在红系细胞中才有消除整合位点的位置效应的功能，因此如果要发挥载体中LCR的功能，则可考虑选择IVlEL-E9细胞；在肝细胞中CMV启动子活性低，此时可考虑选用其它的启动子；使用附加体型表达载体时，应选择其对应的复制允许细胞，等等。
哺乳动物细胞表达系统中，重组蛋白的表达水平与许多因素相关，如转录和翻译调控元件、RNA剪接过程、mRNA稳定性、基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对细胞的毒性作用以及宿主细胞的遗传特性等；而且某些理论上可信的设计在实验中不一定可行，比如含LCr{的载体在MEI，．E9细胞中有时并不能消除整合位点的位置效应嗍，外源基因在染色体高活性位点的定点整合也不一定能获得高表达御，等等。
因此如果需获得一个基因的高表达。
最好多试用几种不同的载体及宿主细胞。
2 提高蛋白表达产量的措施哺乳动物细胞对培养环境十分敏感，营养和生长因子缺乏、缺氧、病毒感染、毒性代谢物的积累、机械搅动以及培养压力的增加等很多固素都可诱导细胞凋亡。
大量细胞的死亡严重影响蛋白的表达产量。
现已证实，有些基因能抑制细胞凋亡，如Bcl-12和BcI-x能抑制许多因素诱发的细胞凋亡，以及某肿瘤细胞从贴壁培养转入悬浮培养而诱发的细胆凋亡。
A1ison等报道，感染dSsV CAT病毒载体的BHK Bcl-12和CHO BcI-x细胞生存期均延长数倍。
BHK Bel 2、HHK BcI-x均使感染SFV II l!的细胞恢复生长到对数生长期的细胞感染后可存活达9 d，LL12的产量提高一倍。
有些化学制剂也能抑制不同阶段的细胞凋亡，如乙酰半胱氨酸tNAC、吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC)等以及caspase抑制剂Z-VAD fmk、YVAD，cmk等，从而大大增加表达蛋白的产量。
高中蛋白质工程步骤
高中蛋白质工程步骤引言蛋白质工程是一门结合生物学、化学和工程学的学科，旨在通过改变或设计蛋白质的结构和功能，来满足特定的研究或应用需求。
在高中生物学教育中，蛋白质工程也是一个重要的研究方向。
本文将介绍高中蛋白质工程的基本步骤和相关知识。
1. 选择目标蛋白质选择目标蛋白质是蛋白质工程的第一步。
高中生一般会选择较为简单的蛋白质，比如乳清蛋白、酵母蛋白等。
选择目标蛋白质需要考虑其在研究领域中的重要性和可行性。
2. 设计蛋白质工程方案在设计蛋白质工程方案时，需要明确研究目的和要达到的效果。
一般可从以下几个方面考虑：2.1 目标蛋白质的改造可以对目标蛋白质进行改造，比如改变其氨基酸序列、添加或删除功能区域等。
这些改造将影响蛋白质的结构和功能。
2.2 蛋白质表达系统的选择在高中蛋白质工程中，常用的表达系统有细胞表达系统和原核表达系统。
根据实验需求选择适合的表达系统，将目标蛋白质在细胞或真核生物中表达出来。
2.3 实验方法和技术的选择根据实验方案选择适合的实验方法和技术，如蛋白质纯化技术、酶活性测定技术等。
确保实验的可行性和准确性。
3. 实验操作流程实验操作流程是高中蛋白质工程的核心部分。
根据实验方案进行以下实验操作：3.1 DNA重组和构建表达载体利用基因工程技术，将目标蛋白质的基因插入到表达载体中，构建蛋白质表达系统。
这一步需要进行DNA重组实验和分子生物学实验。
3.2 表达蛋白质将构建好的表达载体导入到合适的宿主细胞中，使细胞能够表达目标蛋白质。
这一步需要进行细胞培养和转染实验。
3.3 蛋白质纯化利用蛋白质纯化技术，从表达系统中纯化目标蛋白质。
这一步需要进行色谱层析、电泳等实验。
3.4 检测蛋白质功能通过酶活性测定、结构分析等方法，检测蛋白质的功能和结构是否发生改变。
这一步需要进行酶学实验和生物物理实验。
4. 结果分析与讨论通过对实验结果进行分析和讨论，总结出实验结果，并解释蛋白质工程的影响。
还可以结合前人的研究结果，对实验结果进行比较和探讨。
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外源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤: （1）将编码外源蛋白的DNA序列克隆到含有酵母启动 子和转录终止子的表达框中； （2）转化及在宿主中稳定维持该DNA融合产物； （3）外源蛋白在特定培养条件下合成； （4）外源蛋白的纯化与及其天然产物的比较。
3.2 高效表达特性 整合型表 达载体 表达载体 甲醇氧化酶启动子 pAOX1
抑制基因
大肠杆菌表达系统
是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列 使转录在目的基因之后立即停止，避 免多余的转录以节省宿主内RNA的合成 底物，提高目的基因的转录量 防止产生不必要的转录产物，控制目 的基因mRNA的长度，提高 mRNA稳定性， 避免质粒上其它基因的异常表达
终止子
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 外源目的基因的转录系统
蛋白质的翻译系统
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 复制子 选择标记
大肠杆菌表达系统 是一段包含复制起始位点和反式因子 作用区的DNA片段。 大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表 达载体，有效的复制子包含在质粒中
基 因 表 达 系 统
原核生物表达系统
外源基因
原核生物细胞 基因产物
原核生物表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
原核表达载体
大肠杆菌 芽孢杆菌 链霉菌 蓝藻
原核生物表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
原核表达载体
大肠杆菌
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
酵母表达系统的优点：
A.可以大规模生产，有效降低了生产成本 B.收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工 和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳 定 C.很容易纯化
2.酵母表达系统的组成
宿主 自主复制型质粒 质粒载体 选择标记
外源基因表达的相关元件
3.主要酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 乳酸克鲁维亚酵母表达系统 甲醇营养型酵母表达系统 裂殖酵母表达系统
(一)以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系
多数杆状病毒表达载体的构建过程大体如下：
① 将目的基因克隆入合适的转移载体
② 用重组的转移载体和相应的野生性或改造过的野
生型杆状病毒DNA共转染昆虫细胞
③ 用噬菌斑分析分离并鉴定阳性重组体
④ 扩增病毒以进行大规模的蛋白生产
⑤纯化所表达的外源蛋白
多核多角体病毒(MNPv)是应用最广的杆状病 毒载体
高效产 生的关 键因素
醇氧化酶-1（AOX1） 的终止子3’AOX1 酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列
受体菌：蛋白水解酶缺陷型
甲醇营养型酵母表达系统的主要优点：
A.应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控 B.表达质粒易于整合到基因组,不易丢失,适于高度 发酵,产量高 C.表达产物分拣进入过氧化物酶体,利于工业生产和 分离纯化 D.对分泌蛋白的糖基化修饰和糖基化程度适中
复制子
选择标记
使转化体产生新的表型，以便于将转 化了的细胞从大量的菌群中分离出来
大肠杆菌表达系统
氨苄青霉素抗性 四环素抗性 链霉素抗性 氯霉素抗性 卡那霉素抗性 选择标记
显性标记
营养缺 陷标记
使转化体产生新的表型，以便于将转 化了的细胞从大量的菌群中分离出来
大肠杆菌表达系统 原核表达系统结构原件 原核生物 受体细胞
• 该病毒基因组为共价闭合环状双链DNA，长80～200kb， 1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配 2，具有与高等生物相似的蛋白翻译后的加工修饰能力
3，表达水平高，可达总蛋白量的50%；
4，可容纳大分子的插入片段； 5，能同时表达多个基因。
外源蛋白的表达的影响因素
• 高质量的培养基是获得高效表达的前提，
拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的
载体系列
Thank you
2013.01.08
植物表达载体 Ti质粒表达载体
Ti质粒
• Ti质粒 为植物根癌土壤杆菌菌株中存在的 质粒，其特定部位与植物核内DNA组合来 表达信息，使植物细胞肿瘤化。Ti质粒是 在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体 外自主复制的环形双链DNA分子。它控制 根瘤的形成，可作为基因工程的载体。 • 农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列,可以从农 杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。 这段DNA序列叫做T-DNA序列。
DNA复制及重组载体的选择系统 原核表达载体 外源目的基因的转录系统
启动子 抑制基因
终止子
大肠杆菌表达系统 是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别 和结合并指导目的基因转录的DNA序列 启动子 种类: 诱导型启动子,Lac、Trp、λ PR tra组成型启动子,T7噬菌体的启动子 是一种控制启动子功能的蛋白质，对 启动子的起始转录功能产生抑制作用 在适当的诱导条件下可使抑制物失活， 启动子功能重新恢复。
3.1甲醇营养型酵母表达系统
甲醇作为唯一的能源和碳源 表达载体：整合体型载体 筛选标记：组氨醇脱氢酶 基因HIS4 启动子：AOX1 作为分泌型表达时，外 源基因需要接上一段信号 肽序列
我国酵母表达载体产品结构分析
毕赤酵母系统模式表达载体
5’AOX1 启动子片段含有AOX1启动子， 在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达; α -因子信号肽序列为约89个氨基酸的 信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上 清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基 因的插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修 饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3’AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基 因同源重组； 抗Amp基因和pBR322复制起始位点，使 载体可在E.coli中筛选和复制。
A：缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工 B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复 杂的复性才能恢复构象和活性 C：背景杂蛋白很多、纯化起来麻烦 D：表达量一般不是很高
1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点， 发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵 母。 1981年,Hizeman等人首次报道了人重组干扰 素基因在酿酒酵母中表达并获成功。
起始密码子
终止密码子
优势
劣势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读
框架
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
基因克隆表达系统成熟完善
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传 源蛋白
稳定
已发展为一种安全的基因工程实验体系，
细胞周质内含有种类繁多的内毒素
蛋白质表达系统的选择
大肠杆菌表达系统
基因表达系统
DNA
调控 RNA 翻译 中心法则
蛋白质
基因表达系统
DNA
RNA 翻译
蛋白质
基因表达系统
基因表达系统
基 因 表 达 系 统
原核生物表达系统 真核生物表达系统
酵母 植物 昆虫 哺乳动物细胞
... ...
其它
无细胞系统 胚细胞
... ...
基因表达系统
• 农杆菌侵染植物后， Ti 质粒中的 T-DNA 区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体 上。因此，如果把外源基因插入 T-DNA 中， 就有可能携带进入受体植物并整合到染色 体上。 • 农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为 植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁 香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可 以诱导Vir（Virulence region)基因的启动 表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－ DNA 单链切下，而位于根瘤染色体上的操 纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形 成复合物，转化植物根部细胞。
昆虫细胞培养要求相对较高的氧浓度，应
使细胞具有高度活性并维持在对数增长期。
除此之外，使用的载体、启动子、前导肽
以及所表达外源基因的特性也会对表达水
平产生影响。
（二）稳定转化的昆虫表达系统
酵母表达系统
Concept
1
酵母表达系统的产生
2
3 4 5
酵母表达系统的组成
主要酵母表达系统 不同酵母表达系统的特点 酵母表达系统的方法
1.酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成 和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期 以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多 种蛋白。
大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：
农杆菌感染植物细胞的方法
• （1）叶圆片法：用打孔器打取几毫米直径 的叶圆片，表面消毒，进入农杆菌液数秒 后，置于适当培养基上培养2天，，再转到 含有卡那霉素和羧苄青霉素的选择培养基 上培养20天，通过脱分化、再分化长成新 的含有目的基因的植株。
• （2）整株感染：在无菌培养的整株植 株的适当部位上人工造成伤口，用农 杆菌液接种，待形成肿瘤后切下，在 含有抗生素且无激素的培养基上进行 培养并除菌。 • （3）原生质体和农杆菌共培养法：将 除去细胞壁的原生质体与农杆菌共培 养，然后再分化细胞壁、脱分化、再 分化得到含有目的基因的植物植株。
甲醇营养型酵母表达系统的主要不足： A.甲醇不适于食品工业生产 B.易发生火灾
Thank You!
昆虫表达系统 Insect Expression
昆虫表达系统
• 用重组杆状病毒在昆虫细胞系中表达外源蛋白目 前应用较多，对果蝇等昆虫进行稳定转化后可以 获得稳定性和表达效率方面更为优异的表达系统。 • 目前已经利用昆虫表达系统成功地表达了鼠源单 克隆抗体、人一鼠嵌合抗体、单链抗体、人单克 隆抗体及抗体融合蛋白等基因工程抗体分子，这 些抗体分子多数能正确组装，完成糖基化过程， 具有相当的活性。
Ti质粒的转化过程
T-DNA的边界