烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立分析
愈伤组织的诱导形成及分化
愈伤组织的诱导形成及分化第五章愈伤组织的诱导、形成及分化第⼀节愈伤组织的诱导、形成及特点⼀、愈伤组织的诱导和形成愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的⽆特定结构的组织。
经⼀段时间的⽣长和增殖以后，在其内部出现⼀定程度的分化，产⽣出⼀些具有分⽣组织结构的细胞团、⾊素细胞或管状分⼦。
植物外植体在培养基和外界环境的作⽤下，经过⼀个复杂的过程形成愈伤组织，即：外植体＋培养基＋环境愈伤组织愈伤组织的形成⼀般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。
图4.1 愈伤组织的形成特点1. 诱导期愈伤组织诱导期⼜称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂⽅向和代谢⽅式，合成代谢活动加强，⼤量合成蛋⽩质和核酸物质，为细胞分裂做准备。
诱导期的长短因植物种类、外植体的⽣理状态和外部因素⽽异，即使是同⼀种物种不同基因型同⼀外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。
有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），⽽有的植物诱导期需要数天（胡萝⼘）。
刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h ，但经贮藏5个⽉后，诱导期延长为2天。
2. 分裂期外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发⽣分裂，细胞脱分化。
愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜⾊浅⽽透明（见图4.2）。
分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。
⼩麦幼胚分裂期分裂期分化期分化期图4.2 ⼩麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期（东北农业⼤学⼩麦研究室，李⽂雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进⼊分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和⽣理状况⽽有很⼤差异。
烟草、胡萝⼘等的脱分化很容易，⽽⽲⾕类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，⽽成熟的⽼组织较难。
进⼊分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发⽣分化，产⽣新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可⽆限制地进⾏细胞分裂增殖，维持不分化的状态。
高二生物植物的组织培养
第九天（诱导生成愈伤组织）
接种第十九天，绿色生长点进一步发育形成了不定芽， 不定芽长度最长可达1 cm 。
第十九天（长出幼叶）
将不定芽在无菌条件下，从芽的基部切下，然后插入生根培养基 中（1/2 MS），诱导生根。
芽的生根情况
； qq红包群 / qq红包 ；
CaCl· 2 H2 O
3.4
8.8 4.46 1.72 1.24 0.166
微量元素 (200倍)
MnSO4· 4H2O ZnSO4· 7H2O H3BO3 KI
5
NaMoO4· 2 H2O
CuSO4· 5 H2 O CoCl· 6 H2 O
0.05
0.005 0.005 7.46 5.56 0.2 0.05 0.01 0.05 0.01
细胞分裂素类
• 在组培中的作用：促进细胞分裂和由callus或器官上 分化不定芽。
• 常用种类及作用：BAP（苄氨基嘌呤）、6－BA（苄 基腺嘌呤），zip（异戊烯氨 基嘌呤）和KN（激动素） • 使用时先配成母液，母液的浓度一般为0.1 mg/ml或 • 1 mg/ml；配时一般溶于0.5或1 mol/L的HCl或稀薄的 NaOH中，再定容。
3.灭菌： 通常培养基应在汽相121摄氏度的条件下在 高压灭菌锅内灭菌20 min。 在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上 升到0.05 Mpa时，放一次气，然后在温度达121 摄氏度时，保持此压力灭菌15-20 min。灭菌完 成后，待灭菌锅的压力降到0时，打开灭菌锅， 取出培养基，放平，待培养基凝固后备用。
169.02 287.54 61.83 166.064 241.95 分析纯 237.93 249.68
汉语名
硫酸亚铁
烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证
烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证陈辉;姚志恒【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2009(037)014【摘要】[目的]研究烟草愈伤组织的发育情况及其丛生芽或分化点的形态建成.[方法]在无菌条件下,把烟草叶片切块培养在含有2mg/L NAA和1 mg/L6-BA的MS 培养基上诱导愈伤组织的形成;而后,转移愈伤组织到含有NAA 0.1 mg/L+BA 2.0 mg/L的分化培养基上使其产生丛生芽或分化点.[结果]诱导培养20 d后,愈伤组织基本形成且没有发生污染,烟草叶片愈伤组织的诱导培养是成功的.愈伤组织的整体分化率比较高,愈伤组织上形成的丛生芽或分化点比较多,且分布比较均匀;编号为4的分化培养基上愈伤组织的分化不理想,且其丛生芽或分化点分布极不均匀.在烟草叶片愈伤组织的分化培养中NAA和6-BA的添加量分别为0.1和2.0 mg/L.[结论]该研究为植株繁育提供了良好的技术支持.【总页数】2页(P6333-6334)【作者】陈辉;姚志恒【作者单位】荆州职业技术学院,湖北荆州,434020;荆州职业技术学院,湖北荆州,434020【正文语种】中文【中图分类】S572【相关文献】1.培养基和继代时间对番茄叶片愈伤组织诱导和芽分化的影响 [J], 毕建水;李翠翠;徐丽丽2.灵发素(LFS)诱导烟草叶片愈伤组织的研究 [J], 李廷洋;周凤珏;许鸿源;周文亮;龚银花;赖洪敏;陈念平;解云英;许鸿章3.红花烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生 [J], 董行健;余宗波4.迷迭香叶片愈伤组织诱导及再分化培养 [J], 董玉梅;李正楠;钱成;刘宝刚;段如兰;刘雅婷5.汾阳核桃叶片愈伤组织的诱导、增殖及分化培养 [J], 张燕;范宏伟;张国强;张鹏飞;吴国良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化
⑶先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心， 从中仅分化出芽，一般情况下待芽长到一定大小时，切下 移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。
有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根， 形成完整的植株。大多数植物均属这类正常的分化途径， 这类苗移栽较易成活。
⑷先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分 化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的 将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至 在根端也能分化出芽。
从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈 伤组织，大致经历三个时期：
起动期：又称为诱导期,
是愈伤组织形成的起点。 外植体已分化的活细胞 在 外源激素的作用下，
通过脱分化起动而进入 分裂状态，并开始形成 愈伤组织。
起动期
分裂期
分裂期：外植体切口边缘开
始膨大，外层细胞通过一分 为二的方式进行分裂，从而 形成一团具有分生组织状态 细胞的过程。
二、从愈伤组织建立悬浮培养体系
多数悬浮培养物（suspension cultures）是将生长快、质地 疏松的愈伤 小块转移到与愈伤诱导含同样成分的液体培养 基里进行振荡培养而获得。
接种时必须有足够多的细胞块，以保证有较合适的细胞密 度。振荡速度一 般为 30-150rpm。
第一次继代时，应去掉开始时接入的大块细胞团——过滤。
第三节 愈伤组织分化与植株再生
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的生产。 体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一 个体细胞胚称为胚状体，它可以同 合子胚一样发育成植株。 器官发生：指从愈伤组织形成芽及根的过程，芽是一个单 极性结构，物理地同母体组织联结着。
细胞分化
无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化 研究的重点是维管组织的分化，特别是木质部成 分的分化。
烟草光能兼养型愈伤组织的诱导和培养条件
烟草光能兼养型愈伤组织的诱导和培养条件余光辉;梅刘娟;余文卉;游文【摘要】以烟草SR1品种的4周龄叶片为外植体,使用MS＋2 mg/L 2,4 D（2,4-二氯苯氧乙酸）＋0.25mg/L KT（6-糖基氨基嘌呤）＋3%蔗糖＋0.8%琼脂的固体培养基成功诱导了叶片的愈伤组织.通过改变蔗糖浓度和激素配比,对兼性愈伤组织的培养基进行了筛选.结果表明：在500 lxs光照下,蔗糖浓度由3%降至1.5%时,愈伤组织有变绿趋势;蔗糖浓度〈1.5%时,愈伤组织容易出现褐化.2 mg/L NAA（α-萘乙酸）＋0.25 mg/L KT的激素组合可有效诱导愈伤组织的光合兼养,而单一植物激素如NAA和6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）,不是理想的诱导配方.%In this study, 4 weeks of tobacco cultuivar-SR1 leaves were used as the explants and solid culuter medium containing MS ＋ 2 mg/L 2,4-D （ 2,4-dichlorophenoxy ）＋ 0.25 mg/L KT （kinetin）＋ 3 % sucrose ＋ 0.8 % agar was employed to successfully induce the callus formation. Then culture mediums aiming for photoautotrophic facultative callus culture were screened by altering the sucrose concentrations and hormone combinations. Under the irradiation of 500 lxs light intensity, when the concentration of sucrose was reduced from 3% to 1. 5%, the callus tissue was found to increasingly turn green. However, when the concentration of sucrose was reduced to below 1.5% , it easily turned brown. The combination of 2 mg/L NAA （1-naphthlcetic）with 0. 25 mg/L KT can effectively induce the production of photoautotrophic facultative callus, whereas the unique plant hormone, such as NAA or 6-BA （6-benzylaminopurine） can not be used as the ideal medium for such induction.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(031)002【总页数】4页(P42-44,70)【关键词】愈伤诱导;组织培养;光兼养型;烟草【作者】余光辉;梅刘娟;余文卉;游文【作者单位】中南民族大学生命科学学院,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q943.1植物光自养微繁技术是一种生产优质种苗的植物微繁殖技术［1-3］(植物组织培养中以CO2代替糖作为植物体的碳源，控制影响试管苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管苗由兼养型转变为自养型).由于该技术培养条件易控制［4］，污染率和成本低，适于大规模培养［1，2］，同时一些培养的光自养型细胞的光合活力和代谢性能可达到或接近连体叶片水平［5，6］，近年来已成为组织培养技术的新趋势和研究方向，可用来生产某些珍贵药材的药用成分［7，8］. 烟草是转基因技术中常见的材料［9］.近年侧重于以烟草叶片为外植体，研究重金属对烟草叶片组织培养的影响［10］，而将光自养型细胞无糖培养技术成功运用于烟草的报道较少［4，11］.由于自养型愈伤组织中天然活性产物的产量很大程度上受培养条件、时间、激素水平及外源添加物等影响，可通过改变培养条件以优化天然活性成分而达到生产的目的［8］，故笔者在前期建立的银杏和佛甲草异养型愈伤组织的培养体系基础上［7，12］，以4周龄生长旺盛的烟草叶片为外植体，探讨光能兼养型愈伤组织培养的条件，为药物植物光能自养型愈伤组织的培养提供一定的实践和理论依据.1 材料与方法1.1 仪器和试剂超净工作台(SWC-J-A智能型，上海新苗医疗器械制造有限公司)，恒温箱培养箱(SPX-250BS-II型，上海新苗医疗器械制造有限公司).MS(Murashige and Skoog)培养液(上海科兴贸易有限公司)，植物生长激素:2，4-D(2，4-dichlorophenoxy，2，4-二氯苯氧乙酸) 和 NAA(1-naphthlcetic acid，α-萘乙酸)(上海科兴生化试剂有限公司)，细胞分裂激素:KT(kinetin，6-糖基氨基嘌呤，激动素)和 6-BA(6-benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤)(上海拜力生物科技有限公司).1.2 烟草愈伤组织的诱导取4周龄生长旺盛的烟草叶片，先后用清水和蒸馏水清洗2～3次后用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3～4次.用5%次氯酸钠(NaClO)浸泡消毒15min后，无菌水反复冲洗5～7次.灭菌滤纸吸干叶片水分，将叶片切成小块，接种于固体愈伤组织诱导培养基中，置26℃培养箱中黑暗倒置培养.培养基配方为 MS+2 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT+3%蔗糖+0.8% 琼脂.1.3 烟草异养型愈伤组织向光兼养型转变的诱导培养将异养型愈伤组织分别转接于下列4种固体培养基中，进行光自养的诱导.对培养基中的激素配比参考文献［2］，进行简化的正交实验(见表1).培养基中的蔗糖浓度于3% ～1.5%调整，在22℃，光照500 lxs下培养.表1 激素的因素水平表Tab.1 Factor-level of difierent hormones注:实验中 M1、M2、M3、M4 培养基分别为 A1 B1、A1 B2、A2 B1、A2 B2水平组合NAA(A)0.250 mg/L 0.125 mg/L 2.000 mg/L 1.000 mg/L KT(B)1.4 叶绿素含量测定叶绿素含量的测定和计算参考文献［13］.准确称取愈伤组织0.8g/份，加少许CaCO3、石英砂和2 mL 80%丙酮，研磨成匀浆，过滤后用滤液测叶绿素含量.以80%丙酮作参比，分别于663，646nm下测定滤液吸光值，按下列公式计算总叶绿素浓度(mg/L):Ct=17.32A646+7.18A663，叶绿素的含量(mg/g)=色素的浓度(mg/L)×提取液体积(L)×稀释倍数/样品质量(g).1.5 统计方法和计算公式2 结果与讨论2.1 烟草愈伤组织的诱导烟草异养型和兼养型愈伤组织的比较见图1.将烟草叶片接种于诱导培养基上2周后，可观察到质地松软生长情况良好的乳白色透明愈伤组织(见图1a).采用相同的培养基和培养条件，约3～4周继代一次，继代1～2次后，将愈伤组织置于光照(500 lxs)下培养.2周后，愈伤组织逐渐转变为浅绿色(见图1b)，作为进一步光能兼养型愈伤组织培养.实验中，光照条件下，愈伤组织逐渐变绿，由异养型转变为兼养型.但兼养型愈伤组织生长较异养型生长缓慢，且有逐步褐化和死亡现象.由于叶绿体尚未完全形成时，光照对愈伤组织造成光伤害，故实验中须随时注意观察愈伤组织的生长状态，及时继代.2.2 不同激素配比对光兼养型愈伤组织诱导的影响图1 烟草异养型和兼养型愈伤组织的比较Fig.1 Comparison of tobacco heterotrophic calluswith tobacco facultative callusa)异养型愈伤组织.培养基为MS+2 mg/L2，4-D+0.25 mg/L KT+3%蔗糖;b)兼养型愈伤组织.培养基同上激素水平是植物组织培养成功与否关键因素，不同激素配方的诱导率不同.通过对120个愈伤组织块的统计分析，烟草愈伤组织在较大范围的激素浓度配比下均能诱导形成兼养型愈伤组织，但诱导率存在较大差异.M1和M4诱导率最高，分别达71%和67%;M2和M3分别为53%和40%.经χ2检验，M1与 M4、M2与M3差异不显著(P ＞0.05)，M1与M2差异显著(P＜0.05)，即诱导率M1与M4显著高于M2与M3.说明生长素与分裂素(NAA+KT)适宜的浓度配比，有利于兼养型愈伤组织的诱导;而单一的激素如生长素(NAA)或分裂素(6-BA、KT)作用时诱导效果不理想.2.3 蔗糖浓度对光兼养型愈伤组织诱导的影响不同蔗糖浓度对光兼养型愈伤组织诱导的影响见图2.在低强度(500 lxs)光照下，蔗糖浓度由3%降至2%后，愈伤组织有变绿的趋势(见图2a～h).生长于M1和M4的愈伤组织较生长于M2和M3的更绿(见图2a、c、d、h)，其中生长在 M1培养基上愈伤组织颜色最绿，组织最蓬松(见图2a、c).此外，M1和 M4中叶绿素平均含量为 0.202，0.094 mg/g，M2和 M3中为0.065，0.068 mg/g.M1和M4叶绿素的含量较M2和M3高，与肉眼所见的绿色深浅度相符.说明M1和M4培养基更有利于光能兼养型愈伤组织的诱导和形成.继续在光照(500 lxs)下培养，将蔗糖浓度降低至1.5%，M1培养基上的愈伤组织由绿色变为深绿色，新长出的细胞呈现白色，随后逐渐变绿(见图2a、e、i).说明M1培养基的激素配方更有利用于继代培养;当蔗糖浓度＜1.5%时，褐化现象较为严重.因此，完全意义的光能兼养愈伤组织的培养条件尚需进一步探索.3 结语图2 不同蔗糖浓度时烟草兼养型愈伤组织的培养状况Fig.2 Condition of cultured facultative callus of Nicotiana tabacum under different sucroseconcentration～d，e～h，i～l) 分别为含3%，2%，1.5%蔗糖的 M1～M4培养基本实验通过逐渐降低培养基中蔗糖浓度的方法诱导烟草愈伤组织转变为光兼养型愈伤组织，并设计不同的激素配比，建立了诱导培养烟草光兼养型愈伤组织的方法.结果表明:用高浓度的生长素和分裂素的配合有利于兼养型愈伤组织的诱导，MS+2mg/L NAA+0.25mg/L KT 和 MS+1mg/L NAA+0.125mg/L KT两种培养基对兼养型愈伤组织的诱导率较高，分别达71%和67%;而单独使用6-BA分裂素或NAA生长素时兼养型愈伤组织的诱导率较低，仅为53%和40%.在提供光照，逐步降低糖浓度的过程中，不同激素配方中的愈伤组织逐步发育形成了叶绿体，以MS+2mg/L NAA+0.25mg/L KT的激素配方更有利于绿色愈伤组织的继代培养.本实验为研究兼养型愈伤组织中有用的次生代谢成分的产生积累提供了实验基础. 参考文献［1］侯典云，王聪睿，胥华伟，等.植物无糖组培快繁技术的应用［J］.安徽农学通报，2010，16(11):147-148.［2］牟宁宁，高亦珂.植物无糖组培技术研究进展［J］.林业科技开发，2007，21(1):10－12.［3］徐伟忠，丁潮洪，朱丽霞.一种新型光自养微繁体系的建立----植物非试管快繁技术［J］.江西农业学报，2006，18(3):55-59.［4］曾小美，王凌健，夏镇澳，等.胡萝卜光自养型愈伤组织的诱导培养及其光合特性［J］.实验生物学报，2006，36(1):18-22.［5］Carrier P，Chagvardief P，Tapie parison of the oxygen exchange between photosynthetic cell suspensions and detached leaves of Euphoria characias L［J］.Plant Physiol，1989，91(3):1075-1079.［6］Takeda S，Kaneko Y，Matsushinm H，et al.Cultured green cells oftobacco as a usefulmaterial for the study of chloroplast replication ［J］.Meth Cell Sci，1999，21(2-3):149-154.［7］齐小晴，彭斌，胡云虹，等.药用植物佛甲草愈伤组织的诱导和培养［J］.生物技术，2010，20(3):75-77.［8］赵春梅.植物组织培养方法生产药用次生代谢产物研究进展［J］.现代生物医学进展，2008，8(4):790-795.［9］肖军，张云霄，刘伯峰.烟草的组织培养技术研究［J］.泰山学院学报，2009，31(6):94-98.［10］周仕顺，掏志章.烟草的组织培养［J］.云南农业科技，2005，28(5):85-87. ［11］屈云慧，熊丽，张素芳.情人草组培苗无糖培养应用研究［J］.华中农业大学学报，2004，35:192-193.［12］胡云虹，彭斌.银杏愈伤组织和叶中超氧化物歧化酶和总黄酮类抗氧化活性剂活性的比较分析［J］.武汉植物学研究，2010，28(4):521-526.［13］崔勤，李新丽，翟淑芝.小麦叶片叶绿素含量测定的分光光度计法［J］.安徽农业科学，2006，34(10):2063.【相关文献】使用R×2表χ2检验不同激素配方中兼养型烟草愈伤组织诱导率(诱导率=变绿的愈伤组织块数/总的愈伤组织块数×100%)之间的差异，调整每次检验的显著水平α'=2α/(R(R－1))=0.0083，式中R=4(两两检验的样品率个数)，α=0.05.计算ν=3 时χ2值，对 M1、M2、M3、M4 两两比较.。
2 烟草愈伤组织诱导实验
烟草叶片愈伤组织诱导分化实验1. 实验目的（1）通过诱导植物（烟草叶片、水稻种子）愈伤组织和器官发生，分析生长素和细胞分裂素对烟草叶片离体培养的作用。
（2）了解植物组织在离体培养条件下脱分化和再分化的特点。
2. 实验原理外植体形成愈伤组织大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。
启动期主要通过激素以及环境因素的诱导使外植体细胞代谢增强，大量蛋白质与核酸形成为细胞分裂做准备；分裂期时外植体细胞在激素诱导下脱分化并不断增殖，形成结构疏松的组织块；形成期时，由于不同植物生长激素的诱导使愈伤组织形成根、芽等形态分化。
烟草为常见模式植物之一，常用于植物组织培养，是研究细胞脱分化和再分化的理想材料。
在愈伤组织诱导及分化过程中，光照条件起到的作用是促使愈伤组织进行光合作用生成糖类，促使代谢活动进行。
6-BA、NAA均为植物生长调节剂，6-BA属于细胞分裂素，可诱导愈伤组织发生并促进牙的形成；NAA属于细胞分裂素，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。
根据Skoog和Miller提出的生长素和细胞分裂素相对浓度调节器管分化的概念，相对高的生长素有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂素浓度有利于不定芽的分化。
通过改变激素的种类和浓度，有效地调节培养组织的器官分化，已经在许多植物的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物中也得到了证实。
3. 实验材料与操作方法3.1 实验材料3.1.1 材料选择：烟草By-2，滤纸片，枪头3.1.2 实验试剂：（1）植物生长调节剂（超净台过滤灭菌，1.5 mLEP管分装后-20℃贮存）6-BA 0.5mg/mL（1mol/L NaOH溶解再用蒸馏水定容）NAA 0.5mg/mL（1 mol/L NaOH溶解再用蒸馏水定容）（2）抗生素（超净台过滤灭菌，1.5 mLEP管分装后-20℃贮存）卡那霉素50 mg/mL（蒸馏水定容）利福平15 mg/mL（无水乙醇溶解再用蒸馏水定容）链霉素30 mg/mL（蒸馏水定容）羧苄青霉素100 mg/mL（蒸馏水定容）（3）实验用培养基MS大量元素储存母液（50×，蒸馏水定容）：1650mg/L NH4NO3+1900mg/L KNO3+370mg/L MgSO4·7H2O+170mg/L KH2PO4+440mg/LCaCl2·2H2O（CaCl2·2H2O在配制过程中不易溶解，可单独配成储液存放）MS微量元素储存母液（100×，蒸馏水定容）：0.83mg/L KI+6.2mg/L H3BO3+22.3mg/L MnSO4·4H2O+8.6mg/L ZnSO4·7H2O+ 0.25mg/L Na2MoO4·2H2O+0.025mg/L CuSO4·5H2O+0.025mg/L CoCl2·6H2O +27.8mg/LFeSO4·7H2O +37.3 mg/L Na2-EDTA·2H2O（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA·2H2O两个试剂配制成100×溶液4℃冰箱避光储存）MS有机成分储存母液（100×，蒸馏水定容）：3mg/L甘氨酸+0.5mg/L烟酸（维生素B5）+0.5mg/L盐酸吡哆醇（维生素B6）+0.1mg/L盐酸硫胺素（维生素B1）+100mg/L肌醇（肌醇难溶解，一般独自配成浓缩液储存）MS培养基（NaOH调节至pH 5.8，蒸馏水定容）：1×大量元素+1×微量元素+1×有机成分+30g/L蔗糖+0.8%琼脂+不同比例生长素（6-BA+IAA）3.1.3 实验仪器：超净工作台，烧杯，锥形瓶，培养皿，枪形镊子，眼科剪，移液枪，酒精灯，光照培养室，3.2 操作方法取幼嫩烟草叶片约5片（选择幼年的外植体较好，如分生组织、维管束、形成层组织、静止的薄壁组织），用自来水清洗晾干。
11.3愈伤组织的诱导、形成及分化04
注意：
**愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成 分和培养时间而异。 **同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变 异。 **组织培养中涉及到的遗传变异主要是细胞核组成的改变， 变异是不可逆的，这种遗传上的改变可以是染色体畸变，细 胞核破碎，或者是由于细胞内复制引起的多倍性以及分子水 平上的改变等形式。 **培养基成分，特别是外源激素的成分与变异的产生密切有 关。
周继代一次。
** 继代时应注意愈伤组织分割。
Typical callus growth curve. X indicates time for subculture
拟分生组织
**愈伤组织在分裂期会出现导管细胞，筛管细胞，分泌细胞， 毛状体细胞及木栓细胞等，并出现由小而密集的分裂细胞构 成的细胞团，称为拟分生组织。 **这些区域化的细胞团往往在以后分化中称为形成芽原基及 根原基的中心，愈伤组织也经常呈颗粒状的外形，这些颗粒 中含有韧皮部、木质部和形成层组织，这种具有类似微管组 织的愈伤组织颗粒也具有分化形成不定芽和不定根的能力。
在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中，对其调控幅 度最大的是植物生长调节物质，主要调节生长调节物质的 种类、浓度和比例，其中生长素和细胞激动素的浓度和配 比对大多数植物材料愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的 调控起重要作用。对绝大多数植物材料而言，2,4-D 是诱 导愈伤组织和细胞悬浮培养的最有效物质，常用浓度为 0.2～2mg/L，为促进细胞和组织的生长还要加入0.5～ 2mg/L的细胞激动素（KT）。
callus type
胚性愈伤组织 embryogenic callus
成熟胚 mature embryo
幼穗 immatur e spike
第三章-愈伤组织诱导
第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。
持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。
迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。
其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立一、概述烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，是植物组织培养领域中的一项重要研究。
烟草作为一种重要的经济作物，其组织培养技术的研究对于提高其生产效率、优化品质具有重要意义。
愈伤组织的诱导是植物组织培养的第一步，也是后续细胞悬浮培养、基因工程操作等的基础。
烟草愈伤组织的诱导，通常通过无菌操作，利用激素等生长因子刺激烟草叶片等外植体细胞脱分化形成。
这一过程不仅受到激素种类和浓度的影响，还受到光照、温度、湿度等培养条件的影响。
优化诱导条件，降低褐化等不利因素的影响，是烟草愈伤组织诱导研究的关键。
细胞悬浮培养体系的建立，则是进一步将愈伤组织转化为可用于大规模生产和基因操作的细胞悬浮液。
通过选择适当的培养基、调节生长条件、优化细胞悬浮密度等手段，可以实现烟草细胞的稳定增殖和高效表达。
本文旨在探索烟草愈伤组织的诱导条件以及细胞悬浮培养体系的建立方法，通过系统的实验设计和优化，为烟草组织培养技术的发展和应用提供理论基础和实践指导。
这一研究也将为其他植物的组织培养提供有益的参考和借鉴。
1. 烟草愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系的重要性烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，在植物组织培养、基因工程以及植物快繁等多个领域都具有重要的科学意义和实践价值。
愈伤组织的诱导是植物组织培养中的关键环节。
通过特定的培养基和培养条件，可以诱导烟草叶片等外植体脱分化形成愈伤组织。
这一过程不仅验证了植物细胞的全能性，而且为后续的细胞悬浮培养提供了适宜的起始材料。
细胞悬浮培养体系的建立为植物细胞的大规模培养和遗传转化提供了平台。
通过优化悬浮培养条件，可以获得大量生长状态良好的细胞，进而用于后续的基因转化、次生代谢产物生产等研究。
悬浮培养体系还可以用于筛选具有优良性状或抗性的细胞株系，为烟草育种提供新的途径。
烟草愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系在植物快繁方面也具有潜在的应用价值。
通过诱导愈伤组织再分化形成不定芽或胚状体，可以在短时间内获得大量的植株，从而实现烟草的快速繁殖。
本生烟草愈伤组织的诱导和再生体系的建立
本生烟草愈伤组织的诱导和再生体系的建立作者：陆玉建刘俊华王书平高春明刘晓君任宇灵来源：《江苏农业科学》2014年第01期摘要：以本生烟草为材料，研究了不同激素组合对本生烟草愈伤组织诱导和植株再生的影响。
结果表明：当本生烟草叶片在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT培养基中培养时，其出愈率最高，愈伤组织生长状况最好；在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中不定芽生长最快，但存在一定程度的玻璃化现象；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中不定芽长势较慢，但玻璃化程度较轻；对于生根诱导，MS、1/2MS培养基都可诱导不定根的产生，但NAA对根的生长更有效。
关键词：本生烟草；愈伤组织；不定芽；诱导；再生体系中图分类号： S572.043；Q943.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0052-03收稿日期：2013-05-17基金项目：山东省自然科学基金（编号：ZR2012CL14）；滨州学院博士基金（编号：2010Y08）。
作者简介：陆玉建（1979—），男，河南南阳人，博士，讲师，研究方向为植物生物技术。
Tel：（0543）3190096；E-mail：luyujian79@。
烟草是重要的经济作物，常被作为基因工程和分子生物学研究中重要的模式植物[1-5]。
目前烟草遗传转化研究多用普通烟草（Nicotiana tabacum）作为受体，而对本生烟草（Nicotiana benthamiana）的研究相对较少。
本生烟草和普通烟草有密切的亲缘关系[6-7]，由于其植株矮小，生长速度快，生命周期短，对植物病毒非常敏感，所以是基因功能分析和植物病害研究的重要工具[4-8]。
有关本生烟草转基因的研究也见诸报道，通过在本生烟草中瞬时表达促红细胞生成素基因，能够生产重组蛋白-促红细胞生成素[9]。
利用本生烟草建立的质体转化系统，可以用来研究质体和细胞核基因间的相互作用，以及检测质体中相关基因的表达情况[7]。
第四章之二愈伤组织的诱导、形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型
一、定义 callus
在一定条件下从外植体的切口（伤口）部位生成的无 特定结构和功能的薄壁细胞团。 二、愈伤组织的起始条件
创伤+激素
★机械性创伤 ★微生物入侵
★昆虫袭击
三、来源
植物各种器官、组织、细胞均有产生愈 伤组织的潜在可能性
★光照 暗 弱光 ★温度 20-30℃ ★培养基
N源 NH4+/NO3C源 蔗糖
激素 生长素：2,4-D IAA NAA 0.01-10mg/L
细胞分裂素：KT ZT 6-BA 0. 1-10mg/L
二、愈伤组织的形成过程
特点
愈伤组织形成
起始期 分裂期
改变原来的分化方向和代谢方式， 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定 基础
外植体外层细胞开始分裂，细胞脱 分化，愈伤组织结构疏松，缺少组 织结构，颜色浅而透明
形成期
Callus表层细胞分裂逐渐停止， 而转向其内部的局部地区，并改
变分裂面的方向，出现瘤状结构 外表，Callus中可以发现维管组 织，但不形成维管系统
❖ **诱导期长短因植物种类、外植体的生理状 态和外部因素而异，即使同一种物种不同基 因型同一外植体的愈伤组织诱导期也不同。
0.056
80d
0.253 0.227 0.219 0.124
0.063
第四章之二愈伤组织的诱导、 形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型 第一节 愈伤组织的诱导和形成 第三节 愈伤组织的继代及其生长分析 第四节 愈伤组织形态建成 第五节 愈伤组织的形成及其生理生化基础
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生2001级生物技术2班 刘莹 200113831摘要:在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。
本实验通过烟草叶片外植体体外培养，诱导愈伤组织，并分化培养产生再生植株。
Abstract：In the plant tissue culture, the main target is to induce the callus forming and morphogenesis, thus makes a cell, a tissue or an organ in vitro forming the microspores by dedifferentiation, then a plant by redifferentiation. In this experiment we use the explant cultured in vitro to generate the callus and to be regenerated the plant by differentiation.关键词:全能性；组织培养；愈伤组织；分化培养；无菌操作1前言：细胞是生物体的基本结构单位和功能单位。
细胞工程就是利用细胞的全能性，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术[1]。
细胞工程所涉及的基本内容,包括细胞培养、细胞融合、细胞核移植、染色体添加、细胞器转移、胚胎分割、动植物克隆等一系列技术[2]。
在植物学界，早在1902年德国的植物学家哈泊兰德就预言植物细胞的全能性。
1934年荷兰的植物学家温特发现生长素，并证实了对植物细胞培养的作用。
1937年，在法国巴黎的Gautheret实验室、格勒诺布尔的Nobecourt实验室和普林斯顿的White实验室等几个实验室几乎同时获得植物培养物的愈伤组织并长期培养成功[3]。
徐长卿子叶组织培养及再生体系的建立
徐长卿子叶组织培养及再生体系的建立
张嵩岩 ，高 扬 ，陈吻升 ，李铁松 ，姜长阳
（ 宁师范大学 生命科学学 院，辽宁 大连 １６２ ） 辽 １０９
摘 要 ：以徐长 卿子 叶为材料 ，进行愈伤组 织诱 导、愈 伤组织和不定 芽分化、试管苗 生根 、移栽及 移植 等研
管苗移植后 长势 旺盛 ，根 系发达 ，当年 开花 。根据本试验结果 可建 立徐 长卿子叶诱导再 生体 系。
关键词 ： 长卿；组 织培 养 ；无性 系 徐
Ｄｏ： ０３ ６ ￣ｉ ｎ１０ —７ １ ０ ００ ．１ ｉ１ ． ９ ．ｓ．０ ９７ ９ ． １．１ １ ９ ｓ ２ ０
中图分类号 ：Ｑ９ ３１ ４．
文献标 识码 ：Ａ
文章 编号 ：１ ０ —７ １ ０ ００ －０ ５０ ０ ９７ ９ ｅＣｕ ｔ ｒ ｎ ｔ ｂ ｉｈ ｅ ｔｏ ｇ ｎ ｒ ｔ ｎ Ｓ ｓｅ ｓ ｕ ｌｕ ｅａ ｄ Ｅｓａ ｌ ｍ ｎ ｆＲｅ ｅ ｅ ａ ｉ ｙ ｔ ｍ ｓ ｏ ｆ ｒＣ ｎ ｎ ｈｕ ｐａ ｉｕ ａ ｕ ｏ ｙ ａ ｃ ｍ ｎ ｃ ｌｔ ｍ
ｐ ａ ｔｅｓ ｕｌ ｒ ｗｉｈ ｖ ｇｏ ｏ ｓ ｎ ｄ ｌ ｌｔ ｃ ｔ ｅ ｎ ｕ ｔ ｉ ｒ ｕ ａ ｖａｉ ｎ ｃ ｒ ｃ ｅ ｓ ｒ ａ ｔ ｈａ ａ ｔｒ ．Ｂａ ｅ ｎ ｈ ｒ ｓ ｔ ｆ ｔ ｉ ｅ ｐｅ ｉ ｎｔ ｓ ｄ ｏ ｔ ｅ ｅ ｕｌ ｏ ｈ ｓ ｘ ｒｍｅ ， ｉ ｕ ｔｏ ｎ ｅ ｅ ｅ ａｉ ｎ ｓ ｔ ｍ ｆＣｙ ａ ｈ ｍ ｎｄ ｃ ｉ ｎ ａ ｄ ｒ ｇ ｎ ｒ ｔｏ ｙｓｅ ｏ ｎ ｎｃ ｕ ｐａｎ ｃ ｌ ｔ ｍ ｏ ｄ ｅ ｐ． ｉ ｕ ａ ｕ ｃ ｕｌ ｂｅｓ ｔｕ
烟草愈伤组织诱导与植株再生
烟草愈伤组织诱导与植株再生摘要：烟草( Nicotiana tabacum L. )又名草烟，为茄科烟草属的一年生草本植物，是重要的经济作物，常被作为基因工程和分子生物学研究中重要的模式植物[1-5]，具有药用、工业用、保健和美容等多种价值。
近年来有人从花烟草中提取出NaD1,具有抗肿瘤的功效[6]。
利用愈伤组织诱导与植株再生的细胞工程技术来培育烟草可以大大节约烟草的培育成本。
本实验以烟草叶片为实验材料，分别在黑暗、16h/d光周期条件下，用MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L 培养基诱导烟草叶片形成愈伤组织。
用MS+BA 2mg/L + NAA 0.5mg/L培养基全光照诱导分化。
实验结果关键词：烟草；愈伤组织；诱导分化；植株再生；光周期Callus induction and plant regeneration of Nicotiana tabacum LShi Meng-wei(Biotechnology Class 1403)Abstract: Nicotiana tabacum L, also named herbal tobacco, which is classified in Solanaceae Nicotiana L plants, is an annual,as the important Model plant of Genetic engineering and Molecular biology. Tobacco possesses great value in medical, industrial, as well as in cosmetic area. In recent years,NaD1 which has the effect of anti-tumor has been extracted from Nicotiana alata. It is able to save the cost savings of cultivating tobacco by means of callus induction and plant regeneration. In this experiment, the leaves of tobacco are induced the formation of callus in culture medium MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L under the light conditions of completely dark and 16h/d photoperiod, then induced redifferentiation in culture medium MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L.1前言植物组织培养是植物细胞工程中研究得比较早、也比较成熟的技术。
实验5 烟草遗传转化实验2
应用农杆菌介导法的烟草转基因实验一、实验目的烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。
本实验以烟草为实验材料，使同学们了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
二、实验用具及药品烟草叶片，LBA4404质粒载体，摇床，培养皿(带滤纸)，移液枪，镊子，手术刀，无菌水三、实验方法根癌农杆菌介导转化的方法已经比较成熟，易于在植物细胞和组织培养实验室进行。
具体操作程序如下：(1)根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在YEP固体培养基上，YEP 固体培养基的成分为每100mL含NaCl 0.5g，酵母1 g，水解酪蛋白1g，琼脂1.5g，pH值7.0，在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。
(2)配制YEP液体培养基：成分同上，只是不添加琼脂，分装于试管中，每试管加入5mL 左右的液体培养基，包好后高压灭菌，放置于冰箱中待用。
(3)摇菌：用灭菌后的牙签或者火柴棍等挑出一些菌液，一起放入上述YEP液体培养基中，然后置于振荡器上摇菌16—17h(180r／min)，直至溶液变浑浊，即有大量菌丝长出。
(4)用消毒后的0.5mm打孔器从叶片上切出叶盘，然后将叶盘投入农杆菌悬液中培养5min(5)用滤纸吸干多余的菌液，叶片放在MS+6-BA 1.0 mg/L十IAA 0.1 mg/L培养基上共培养2d，随后转至附加卡那霉素100mg/L，羧苄青霉素500 mg/L的培养基上筛选培养，(25±1)℃，16h光周期。
(6)2周后分化出卡那霉素抗性芽（应为绿色），从基部将芽切下，转至含100mg/L卡那霉素和500 mg/L羧苄青霉素的MS+0.1 mg/LIAA上生根培养，生根后的植株移入温室内栽培。
四、预期结果愈伤组织：一周后在脱分化培养基上长出淡黄色、松散的愈伤组织。
幼芽：愈伤组织转入分化培养基两周后分化出卡那霉素抗性芽。
生根：芽转入生根培养基后可以生根。
第三章_愈伤组织诱导及分化调控
1. 外植体的选择 需考虑以下因素:
(1) 外植体的基因型 (2) 同一植物不同部位外植体，其细胞的分化能
力有相当大的差别 (3) 植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更
容易去分化
一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度， 取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细 胞分化程度和生理状态
再生植株：器官发生(organogenesis)和体细胞 胚胎发生(somatic embryogenesis)
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的 生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着 于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以 同合子胚一样发育成植株。
器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈 伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器 官的过程 。
从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受 精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖 细胞的低。
全能性实现的两个必须满足的条件： 把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影
响下解脱出来 要给予植物细胞一定的刺激
二、几个重要的概念
外植体（explant): 植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，
（2）物理因素 光：
很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生， 说明光周期并不是非常重要的因子
有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而 在连续光照下则不能
尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期， 多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗
温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉 花就不一样
B
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生
Uc= (p 光-p 暗)/ p 平均=-0.6686 | Uc |=0.6686＜uα/2=2.58，故接纳 H0，拒绝 H1，即光照培养和黑暗条件下
培养的愈伤组织的诱导率无明显差异
3.3.2 平均每个愈伤组织分化芽数的差异显著性分析 假设：H0 是没有显著差异的
不同光照条件对愈伤组织诱导情况的方差分析表
注意在夹取外植体时动作要快，也要注意在对镊子高温消毒后要适 当冷却，否则会造成外植体失水或者烫伤而影响生长。并且要严格进行 无菌操作。
2.4 烟草植株的再生
将上述愈伤组织按类型顺次转到分化培养基上，接种 18 瓶，20~22 条 件下连续光照培养 3~4 周，直到长出芽。
3 结果与分析
3.1 愈伤组织诱导
态发生，使一个细胞、一个组织或一个器官的细胞通过脱分化形成愈伤组 织，并再分化成植株[2]。为了获得用于细胞大量培养的培养物，要从植物 不同的部位诱导生长旺盛的愈伤组织[3]。所谓愈伤组织原是指植物在受伤 后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中则指在人工培养基上 由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞[4]。目前组织培养中能重复地 形成愈伤组织和再生植株的一般限于从活跃分生组织部分而来的外植体， 如不成熟的幼胚、幼叶和幼花序，叶肉组织是一般常用的起始材料[5]。得
到愈伤组织以后，在愈伤组织继代培养时需要通过改进培养基和调整培 养温度与光照对培养条件进行优化，以获取最大的生物量和有用成分的 产率。
烟草是植物组织培养的四大典型实验植物之一，也是一种重要的经 济作物，在国民经济发展中起着重要的作用。目前，通过烟草的花药培养， 原生质体培养，以及烟草叶组织培养已经成功获得烟草的体外再生植株。 烟草组织培养技术的成熟，为烟草的快速繁殖和新品种的筛选打下了坚 实的基础。
烟草植物组织培养实验报告2223
不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸 （NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米 素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。 激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸 需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母 液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃） 保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为 0.5mg时，则取1ml母液即可。
在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态 发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过 脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一 块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动 期、分裂期和形成期。
培养基配方设计是组培法育苗中的关键步骤。根据理论与 实际经验，对不同种类的花卉及不同的取材部位，需设计出相 适应的配方，并从中筛选出最佳者。
母液浓缩倍数
培养基要求的含量 公式2：母液吸取量= ———————————（各种生长调节剂）
母液每CC的含量
（二） 各种母液按顺序编号排列 A. 大量元素；B.CaCl2.2H2O； C.微量元素 ；D.铁盐； E.有机 物； F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA 用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、 激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT用少量1N HCL溶解后, 加蒸馏水定容至100ml。
S4实验四 植物叶片愈伤组织的诱导培养(理论)
实验四植物叶片愈伤组织的诱导培养（理论）一、概念愈伤组织（callus）◆自然状况下指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。
◆植物组织培养中，指在人工培养基上由外植体组织增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞。
二、植物愈伤组织及形成过程外植体形成愈伤组织，标志着植物组织培养的开始。
1、形态结构◆形状不规则，结构疏松◆有大量的分生中心◆细胞排列毫无次序◆内有大量的细胞间隙◆颜色不一致优良的愈伤组织所具备的特性：A、高度的胚性或再分化能力，以便从愈伤组织得到再生植株B、易散碎，可建立优良的悬浮体系，并可分离出全能性的原生质体C、旺盛的自我增殖能力，可建立大规模的愈伤组织无性系D、经过长期继代保存而不丧失胚性，可进行各种遗传操作2、愈伤组织形成过程A、诱导期◆细胞准备分裂◆合成代谢活动加强◆细胞大小基本不变诱导期时间长短因植物种类、外植体生理状况及外部因素而异B、分裂期◆一分为二，不断增殖◆形态结构与生理生化发生变化主要表现：◆数目迅速增加◆细胞平均鲜重下降◆细胞体积小◆核与核仁增至最大◆ RNA减少，DNA保持不变◆组织总干重、蛋白质与核酸含量增加◆新细胞壁合成极快C、形成期细胞经诱导、分裂形成无序结构愈伤组织的时期。
细胞特点：◆大而不规则、高度液泡化◆无次生细胞壁与胞间连丝◆整个组织松散◆表面以下约5~10个细胞生长中心本时期的愈伤组织是最适合获得单细胞或原生质体的，是建立悬浮体系的最好时期。
D、分化期停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。
本期愈伤组织特点：◆细胞分裂部位由表层转变到深层◆分裂方向由单周分裂变为深层局部分化◆分化组织瘤状结构形成◆维管组织形成瘤状结构的出现使愈伤组织逐渐形成具有维管组织，呈分散的节状结构形成，出现各类组织细胞。
细胞分裂素对促进维管化组织有重要作用3、愈伤组织的继代培养◆长期保存愈伤组织的一种方法◆直径到2~3cm时与外植体分离，单独培养◆选取其生长迅速的部位作继代培养◆分化与再生植株时，应选生长较慢的愈伤组织◆每一继代培养时间取决于其生长速度◆一般可在3~6周继代一次三、植物愈伤组织的遗传变异1、引起异质性的原因A、外植体染色体倍数性与遗传组成不同的细胞经诱导后的分裂B、培养条件引起的不规则性它们常同时发挥作用2、初生愈伤组织接种到培养基上后，细胞核内的变化：A、正常有丝分裂B、先核内复制，后有丝分裂C、先核碎裂，后有丝分裂◆初生愈伤组织的异质细胞群体性反映了外植体中的染色体状况反映了愈伤组织诱导期间核变异的结果◆在诱导中，会出现二倍体、多倍体、单倍体、非整倍体与染色体结构变异体等3、建成愈伤组织◆选择作用的结果◆只有一种主要核型占优势◆培养基成分和培养类型的影响◆异质群体中细胞间的竞争与互作的影响四、影响因子及培养条件1、培养基2、组织原有的倍数性3、培养环境的条件五、愈伤组织的发生方式发生方式：1、器官发生指细胞或愈伤组织通过形成不定芽再生成植株的过程。
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烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立
实验目的： 1.通过实验，掌握无菌操作方法，熟悉烟草愈伤组织 的诱导及再生体系的建立的整个过程。 2.学习再生体系的建立方法，为掌握其他植物的组织 培养奠定基础；同时为转基因技术提供一个平台。
再生体系的建立主要应用于以下几个方面： 1、用于验证植物细胞的全能性。 2、是植物基因工程的重要基础，外源基因 转入受体细胞，受体细胞通过脱分化形成愈伤组 织，愈伤组织通过再分化形成植株，从而获得转 基因植株。 3、也是植物快繁的一种方式，通过诱导愈 伤组织再分化，能够在短时间内形成大量的不定 芽或草无菌苗的叶片 （或上述消过毒的叶片），剪成（0.5～1cm） *(0.5～1cm)大小的小块，接种于诱导培养 基MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L中诱导 愈伤组织，在此培养基上能诱导出愈伤组 织并能够诱导出不定芽。 三）不定芽生根： 将在愈伤组织中生成的不定芽移栽到1/2 MS培养基中，其目的是诱导不定芽生根， 使其发育成烟草小植株。
实验步骤 一）材料的消毒 ： 1）剪取生长健壮的叶片，最好带有叶柄。 2）将整个叶片（包括叶柄）全部浸入70％的乙醇中， 不断振荡30 s。 3）将乙醇倒掉，迅速加入0.1％ 的升汞，再将整个叶片 （包括叶柄）全部浸入0.1％ 的升汞中，不断振荡 10 min。 4）于工作台上用无菌镊子将上述叶片夹入无菌烧杯中， 同时将升汞倒入盛有硫化钠的桶里。 5）用无菌水冲洗上述叶片3－5遍，取出后用无菌滤纸 吸干，备用。
接种第一天
接种第二天，因为外植体细胞开始被诱导脱分化， 并不断分裂增殖，造成叶片中央与边缘的细胞分 裂不均匀，因此，叶片中央凸起。
接种第五天，脱分化细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织， 表现为叶片边缘泛黄增厚，叶片中央进一步凸起。
接种第九天，脱分化细胞不断增值，愈伤组织 不断增厚，整个叶片都翘起，并且已经开始再 分化形成绿色生长点。
第九天（诱导生成愈伤组织）
接种第十九天，绿色生长点进一步发育形成了不定芽， 不定芽长度最长可达1 cm 。
第十九天（长出幼叶）
将不定芽在无菌条件下，从芽的基部切下，然后插入生根培养基 中（1/2 MS），诱导生根。
芽的生根情况
实验原理
分化了的植物叶片细胞往往具有全能性，因 此将烟草叶片从植株上分离后，给予一定的培养 条件，可以诱导叶片细胞脱分化，脱分化的细胞 不断分裂就形成愈伤组织，愈伤组织再在合适的 培养条件下又能够再分化形成完整植株，烟草愈 伤组织的再分化是以不定芽的方式，即愈伤组织 先形成不定芽，再由不定芽形成完整植株，从而 完成了再生体系的建立。