细菌耐药表型的检测方法

四、金属β-内酰胺酶的表型检测方法
1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平 板上。 （2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片 中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙 酸，35℃孵育18-24h。 （3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大 于单个头孢他啶的抑菌圈（≧4mm），则为阳性，即产金 属β-内酰胺酶。
附：鉴定卡他球菌方法
1.40%KNO3浸湿滤纸条，贴于羊(马)血平板上，周 围点种待测菌，如果菌落周围出现大的绿色环 ， 即为阳性。 2.丁酸酯酶检测法：购买丁酸酯酶检测纸片(梅里埃 公司生产)，涂细菌于纸片上，如几分钟内出现绿 色为阳性。
金属β-内酰胺酶的表型检测方法
2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H 平板上。 （2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚 胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h。 （3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性， 即产金属β-内酰胺酶。
耐药机制 红霉素 克林霉素 基因型 ―――――――――――――――――――――――
泵出(MS) 核糖体基因诱导变异 （ermC为主） 核糖体基因结构变异 （ermA为主） R (iMls) (cMLS) S R R MSRA D-Test(+) R
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七、其它耐药表型检测 1.MRSA，MRCNS 2.VRE 3.PRP 4.泵出机制：美平/泰能（MIC）≥1
细菌耐药表型的检测方法
细菌耐药表型的检测
一、β-内酰胺酶的检测
（1）头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸 片→灭菌水湿润→涂测试菌于纸片上，10min观察 纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观 察）。 （2）酸度法：青霉素→β-内酰胺酶水解→青霉酸、 pH6.8以下→酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液 pH8.5）变为黄色。 （3）碘测定法：β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环，碘与 破坏后的β-内酰胺结合，使兰色的淀粉—碘复合物 转变成无色。 （4）仪器测定法：Vitek、Microscan的药物测试卡 中均带有检酶功能。
敏感即疑为产 Ampc ，如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈
≥5mm可能产ESBLS。 2.确认试验（头孢西汀三维水相试验法）
AmpC酶新的检测方法
3.三维水相试验方法的改进 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均 匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在距 纸片边缘1cm处，用无菌手术刀片切3cm长度的小槽，将 待测菌株的6个菌落接种于槽内(勿溢出槽外)，35℃孵育 18-24h。 （3）结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即AmpC酶阳性。
二、ESBLS检测 （ 1 ）纸片扩散初筛：头孢他啶（ 30μg/ 片） 抑菌圈≤22mm 头孢噻肟（30μg/片）抑菌圈≤27mm 头孢曲松（30μg/片）抑菌圈≤25mm 氨曲南（30μg/片）抑菌圈≤27mm （ 2 ）肉汤稀释法：上述药物 MIC≥2μg/ml 可 疑为 ESBLS。（表型确证试验：对 2个任何 一个药物MIC，在加克位维酸比不加克拉维 酸的 MIC 值降低 3 个以上对倍稀释度判为 ESBLS）。
六、D-Test试验
（1）将待检菌按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布 于M-H平板上。 （2）在M-H平上板贴一片红霉素 (15ug/片) 纸片， 在距纸片边缘1.5cm处贴克林霉素 (2ug/片) 纸片。 （3）35℃孵育18-24h，如克林霉素出现扁平或凹 陷的抑菌环为阳性。
D-Test试验耐药表型判断
（3）双纸片协同确认试验： 头孢他啶（ 30μg/ 片）与头孢他啶（ 30μg ） / 克位维 酸（10μg） 头孢噻肟（ 30μg/ 片）与头孢噻肟（ 30μg ） / 克拉维 酸（10μg）两纸片抑菌圈相比≥5mm即为ESBLS。 （ 4） E-test法（浓度梯度法）：由瑞典 AB Biodisk 公司研究生产，广洲贝肯公司经销。试条中的三代 头孢菌素或氨曲南的 MIC≥2μg/ml 即可疑为 ESBLS 。
（ 5 ） 仪 器 测 定 法 ： Vitek,microscan 和 BDPHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS。 （ 6 ）利用分子生物学技术（ PCR 、 DNA 探针等） 及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检 测技术可对ESBLS做出确诊。
三、Ampc酶检测
1.初筛：
（ 1 ）头孢西汀（ 30μg/ 片）与头孢西汀。后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑为Ampc。 （2）5种纸片筛选：马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与 头孢他啶 /克拉维酸。如头孢西汀 ≤ 18mm ，对马斯平、泰能
五、肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证 （2009年CLSI:M100-S19.APPB.124）
1.如果菌株对碳青霉烯类药物表现为“I”或“R”没必 要再去检验该酶，（医生通常不会选用“I”或“R” 的药物），但主要以感染控制为目的检验该酶。 2.什么是碳青霉烯酶？ 一类能水解或灭活碳青霉烯类抗生素的酶，如： KPC（肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶）. • 碳青霉烯类抗生素 －Doripenem（目前无CLSI折点） －厄他培南 －亚胺培南 －美洛培南
3.肠杆菌科碳青霉烯敏感及碳青霉烯酶筛选的折点
＊亚胺培南不用于变形/普罗威登/摩根菌属中碳青霉烯酶的筛选。因为这些菌属会产 生非碳青霉烯酶导致的亚胺培南MIC升高。 ＊＊NA：不可用（本试验不适用于筛查）
4.什么时候做改良Hodge试验？ • 如果头孢噻肟、头孢他啶和 /或头孢曲松全部“R”。 • 注：头孢比肟对于碳青霉烯酶产生株的结果是不稳定的。 • MIC（μg/ml) 抑菌圈(mm) • 厄他培南 2 19-21 • 亚胺培南＊ 2-4 NA ＊＊ • 美洛培南 2-4 16-21 5.做改良的Hodge试验（确证试验） （1）ATCC25922配成0.5麦氏浊度，1：10稀释。 （2）用棉签满涂布于MH平板上，就像纸片扩散法药敏试验 一样，在中心加一张厄他培南或美洛培南（最好）纸片。 （3）取待测菌（1－3号）从纸片边缘向外划（用1μl接种 环）。 （4）35℃培养过夜后，观察结果。 （5）大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生。
※三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法).
AmpC酶新的检测方法
4.质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法 操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片， 在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul， PH8.0，1M Tris-0.1MEDTA）。 （3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）。 （4）35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的 抑菌环为阳性。
6.改良的Hodge试验：检测碳青霉烯酶活性的 表型试验，在检测KPC方面有>90％的敏感 性/特异性，检测其他碳青霉烯酶时敏感性/ 特异性不定（如：低水平的金属酶）。 7. 改良Hodge试验的质量控制(2009年 CLSI:M100-S19.APPB.124)： 随患者菌株 每天检测。 （1）改良Hodge试验阳性菌株: 肺克ATCC BAA-1705 （2） 改良Hodge试验阴性菌株：肺克ATCC BAA-1706