第10章分子杂交技术hu优秀课件
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▪ 变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性 质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升 高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过 程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的 变性曲线或熔解曲线。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度 或熔解温度（melting temperature,Tm)， 此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核 酸的G、C含量有关。
作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30-50bp， 探针上需标记上可直接检测的元素或分子。
▪ 3、杂交
将处理后结合在硝酸纤维素膜上的待检样品 与溶液中的标记探针进行杂交，杂交前要进行 预杂交，即用非特异性核酸溶液封闭膜上的非 特异性结合位点。
▪ 4、检测
▪ 依据标记探针的方法而异，用放射自显影或免 疫组化的方法来进行检测。
③ 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进行杂交。
④ 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可 吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。
⑤ 杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部 分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与 杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时， 一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗 膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异 性。
预杂交
为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非 特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非 特Байду номын сангаас位点封闭。在杂前的这些处理过程称为 预杂交。
常用于预杂交的封闭物：
▪ 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛 胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附 样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域， 使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性， 在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使 背影清晰。
⑤ 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上 磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复 性。离子强度过高则不利于复性。
分子杂交的基本过程
▪ 1、样品制备 从待检样品提取DNA或RNA。DNA先用酶消化成大
小合适的片段，然后用凝胶电泳进行分离，再将含 DNA片段的凝胶做变性处理，转膜固定。RNA样品可 直接在变性条件下电泳分离，然后转膜固定。 ▪ 2、探针制备
▪ 灵敏度高（<1pg互补序列） ▪ 速度快（<24h） ▪ 简单易行
应用：
▪ 基因克隆的筛选 ▪ 酶切图谱制作 ▪ 基因组中特定基因序列的定量和定性检测 ▪ 基因突变分析 ▪ 疾病的诊断、微生物病原体检测
第一节 核酸杂交基本原理 第二节 核酸探针标记的方法 第三节 几种常见的杂交 第四节 其他类型杂交介绍 第五节 原位杂交
1、寡核苷酸探针 2、基因组DNA探针 3、cDNA探针 4、RNA探针 5、单链DNA探针
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低， 熔解温度也低。
2、复性
▪ 在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新 结合，形成双链的过程称为复性。
▪ 在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低2030℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结 构，这样的复性又称为退火。
1、变性：
在某些理化因素的作用下，核酸双链分子 碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链 螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构 被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
▪ 引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂
（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
▪ 加热变性是最常用的方法，一般加热 80100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分 开。
▪ 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非 特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括 聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。
第二节 核酸探针标记的方法
一、核酸探针
定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特 异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸 探针带有特殊的标记物。
核酸探针的类型：
复性过程：
第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链， 这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基 不能配对就会重新解离，一旦找到正确的 互补区，则其局部双链形成核（成核反 应），然后核两侧的序列迅速配对，形成 完整的双链分子。
影响复性的因素
① 单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单 链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。
② 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对 的难度也大，复性也慢。
③ 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长 度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。
④ 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数 碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比 Tm低25℃。
第一节 核酸分子杂交的基本原理
▪ 分子杂交(简称杂交，hybridization)是核酸研究 中一项最基本的实验技术。
▪ 原理：
应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不 同的DNA(或RNA)片段，按碱基互补关系形成杂交 双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与 DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。杂交的 本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。 因此，变性技术也是核酸杂交的一个环节。
第10章分子杂交技术hu
定义： 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测
样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的 原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法， 将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段， 也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
特点：
影响核酸分子杂交的因素：
① 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。 但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高 也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度 越慢；复杂性越高，配对难度也增大。
② 离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸 基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形 成。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度 或熔解温度（melting temperature,Tm)， 此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核 酸的G、C含量有关。
作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30-50bp， 探针上需标记上可直接检测的元素或分子。
▪ 3、杂交
将处理后结合在硝酸纤维素膜上的待检样品 与溶液中的标记探针进行杂交，杂交前要进行 预杂交，即用非特异性核酸溶液封闭膜上的非 特异性结合位点。
▪ 4、检测
▪ 依据标记探针的方法而异，用放射自显影或免 疫组化的方法来进行检测。
③ 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进行杂交。
④ 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可 吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。
⑤ 杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部 分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与 杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时， 一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗 膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异 性。
预杂交
为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非 特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非 特Байду номын сангаас位点封闭。在杂前的这些处理过程称为 预杂交。
常用于预杂交的封闭物：
▪ 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛 胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附 样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域， 使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性， 在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使 背影清晰。
⑤ 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上 磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复 性。离子强度过高则不利于复性。
分子杂交的基本过程
▪ 1、样品制备 从待检样品提取DNA或RNA。DNA先用酶消化成大
小合适的片段，然后用凝胶电泳进行分离，再将含 DNA片段的凝胶做变性处理，转膜固定。RNA样品可 直接在变性条件下电泳分离，然后转膜固定。 ▪ 2、探针制备
▪ 灵敏度高（<1pg互补序列） ▪ 速度快（<24h） ▪ 简单易行
应用：
▪ 基因克隆的筛选 ▪ 酶切图谱制作 ▪ 基因组中特定基因序列的定量和定性检测 ▪ 基因突变分析 ▪ 疾病的诊断、微生物病原体检测
第一节 核酸杂交基本原理 第二节 核酸探针标记的方法 第三节 几种常见的杂交 第四节 其他类型杂交介绍 第五节 原位杂交
1、寡核苷酸探针 2、基因组DNA探针 3、cDNA探针 4、RNA探针 5、单链DNA探针
Tm=（G+C）%×0.41+69.3
Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低， 熔解温度也低。
2、复性
▪ 在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新 结合，形成双链的过程称为复性。
▪ 在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低2030℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结 构，这样的复性又称为退火。
1、变性：
在某些理化因素的作用下，核酸双链分子 碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链 螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构 被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
▪ 引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂
（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
▪ 加热变性是最常用的方法，一般加热 80100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分 开。
▪ 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非 特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括 聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。
第二节 核酸探针标记的方法
一、核酸探针
定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特 异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸 探针带有特殊的标记物。
核酸探针的类型：
复性过程：
第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链， 这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基 不能配对就会重新解离，一旦找到正确的 互补区，则其局部双链形成核（成核反 应），然后核两侧的序列迅速配对，形成 完整的双链分子。
影响复性的因素
① 单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单 链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。
② 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对 的难度也大，复性也慢。
③ 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长 度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。
④ 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数 碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比 Tm低25℃。
第一节 核酸分子杂交的基本原理
▪ 分子杂交(简称杂交，hybridization)是核酸研究 中一项最基本的实验技术。
▪ 原理：
应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不 同的DNA(或RNA)片段，按碱基互补关系形成杂交 双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与 DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。杂交的 本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。 因此，变性技术也是核酸杂交的一个环节。
第10章分子杂交技术hu
定义： 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测
样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的 原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法， 将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段， 也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
特点：
影响核酸分子杂交的因素：
① 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。 但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高 也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度 越慢；复杂性越高，配对难度也增大。
② 离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸 基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形 成。