第3章 抗体制备

１.亲和层析法
交叉杂抗原
Sepharose4B
抗体
单价特异性抗体
２、吸附法
交叉抗原液
＋
双功能交联剂
固相吸附剂
抗血清 收集上清液
第四节 单克隆抗体的制备及应用
一、杂交瘤技术的基本原理
细胞工程抗体——杂交瘤-单克隆抗体
二、杂交瘤细胞 的 制备过程
致敏的B淋巴细胞
杂交瘤
骨髓Baidu Nhomakorabea细胞
三、单克隆抗体的生产
★配体的选择条件：
①抗原或抗体必须单一特异性；
②抗原与抗体具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。
★抗原或抗体与支持物的结合： ①活化：溴化氰；
②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨 基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、 重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。
★亲和层析条件的选择：
①封闭活性基团 ②除去未结合和结合不牢的蛋白
一、佐剂的种类
化合物 生物制剂
人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休 克蛋白 动物的佐剂：弗氏佐剂
弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)： 弗氏完全佐剂－羊毛脂 与液体石蜡的混合物 弗氏完全佐剂－弗氏不 完全佐剂加卡介苗
乳化方法： 研磨法和搅拌混合法
弗氏佐剂(Freund adjuvant)
5.亲和层析法
是利用生物大分子的生物学特异性， 即生物分子间所具有的专一性亲和力而 设计的层析技术。
特点：纯化效率高，速度快，有时仅一 步即可达到纯化目的。
★亲和层析支持物的选择： ①非特异性吸附低；
②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；
④有合适丰富的化学基团 ⑤有丰富的微，以增加结合容量。
（二）可溶性抗原的提取和纯化 1.超速离心法： 差速离心法－低速和高速交替进行
密度梯度离心法－区带离心法
方法
差速离心 梯度密度离心
2.选择性沉淀法： 核酸去除法－氯化锰、鱼精蛋白
盐析法－硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇
盐析沉淀法
原理：利用各种蛋白质在不同浓度的盐溶液 中有不同的溶解度。 优点：方便、有效、不影响蛋白质活性 应用： 抗原的初筛
第三章
抗体制备
医学技术学院免疫教研室
教学目的
掌握：颗粒性抗原的制备、可溶性抗原的
制备 熟悉：可溶性抗原的纯化--盐析法
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 并能与抗体发生反应的物质。
免疫原：颗粒性抗原
可溶性抗原
半抗原性免疫原
一、颗粒性抗原
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原 鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵
抗原
抗血清1:8
1:16 1:32
1:64 1:128 N.S
抗体效价的鉴定（双向免疫扩散法）
测定抗血清效价有两种稀释方法： ①稀释抗血清 ②同时稀释抗原和抗血清（棋盘滴定）
1.抗体效价和纯度的测定
可用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法 鉴定纯度，如出现多条电泳带，即提示 3.亲合力鉴定 抗血清中杂蛋白较多，需近一步纯化。
真空干燥：5-10年
六、 抗体的纯化
最常用的纯化方式是提取抗血清中的 特异性IgG或单价抗体。
（一）IgG类抗体的纯化
免疫动物来源的抗血清中，主要富含特 异性IgG，纯化后的特异性IgG最常用于标 记免疫或其他技术中。
盐析法 亲和层析法 离子交换层析法
1.盐析法
（1）硫酸铵盐析法： （2）硫酸钠法（ 20% ）
1. 增强抗原免疫原性，使免疫原持久
2. 增强对抗原反应性，提高抗体产生效
价
3. 引起或增强迟发型超敏反应

三、佐剂的作用机制
长停留时间、有助于APC对抗原的摄取。
1.改变抗原的物理性状、延缓抗原降解、延
2.活化APC，增强APC对抗原的加工和提呈
3.刺激淋巴细胞增殖分化，扩大免疫应答
第三节 多克隆抗体的制备 及应用
（1）超声破碎法
原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎 特点：①操作简单，重复性较好，节省时间
②多用于微生物和组织细胞的破碎
（2）酶处理法
常用酶类：溶菌酶（碱性环境）
方法：EDTA--革兰氏阴性菌细胞壁
特点：①此法适用多种微生物； ②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。
2.抗体特异性的鉴定（双向免疫扩散法）
粗抗原 纯抗原 粗抗原 纯抗原 粗抗原 纯抗原
1
2
3
抗血清
抗血清
抗血清
动物已产生单价特异性抗体 未免疫成功 免疫成功，但需将杂抗体吸收去除，制备成 单价特异性抗体
3. 抗体亲和力的鉴定
ELISA 放射免疫等
4. 抗血清的保存
2℃-8℃：短期保存 -70℃~-20℃：2-3年
液体石蜡 ＋ 羊毛脂 混合 弗氏不完全佐剂
抗原
卡介苗
完全乳化
鉴定
高压 备用灭菌 加热
弗氏完全佐剂
水中 一滴 乳剂
乳剂不 •作用大于不完全佐剂 散浮于 •局部形成肉芽和溃疡 液面 •不能用于人体
细胞因子佐剂 IL-1、IL-2、INF、GM-CSF
应用: 抗寄生虫免疫 抗肿瘤免疫
二、佐剂的生物学作用
血细胞抗原制备
细菌抗原制备: 多用液体或固体纯培养 物，经集菌后处理。
寄生虫和真菌抗原制备: 除用破碎法加 工粗提外，大多要加以适当纯化。
二、可溶性抗原 （一）组织和细胞可溶性抗原的粗提
1.组织细胞抗原的制备： 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
组织和细胞成分混合抗原制备程序
第五节 基因工程抗体及应用
人源化抗体 小分子抗体 双特异抗体 抗体融合蛋白 噬菌体抗体库技术 重组多克隆抗体 基因工程抗体的应用

思考题
1．如何制备可溶性抗原？
2. 如何制备抗血清？ 3．抗血清的鉴定包括哪些内容？
小结
抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有
多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞
提取丙种球蛋白
抗原的浓缩
水溶性非离子型聚合物沉淀法
常用的聚合物： 聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖 应用： 3%-4% PEG沉淀免疫复合物 6%-7% PEG沉淀IgM 8%-12% PEG沉淀IgG
12%-15% PEG沉淀其他球蛋白
25% PEG沉淀白蛋白
3. 凝胶层析法
样品溶液缓慢流经凝胶柱时，大分子短 时间内被洗脱出来；小分子物质缓慢地流 出分子筛柱；通过凝胶的分子筛作用,大、 中、小三类分子彼此间较易分开。 特点：简单易行，但掌握不好，分离效果 较差。
目的： 获取高质量抗体用于 检测抗原或抗体同时 也为诊断性试验提供 特异的诊断试剂
抗血清的制备是将制备好的免疫原按 照一定的免疫程序接种给所选择的动 物，该动物在含有多种抗原表位的抗 原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活 并产生针对某一抗原多种不同表位的 抗体，其混合物为多克隆抗体
多克隆抗体 天然抗原刺激多种B 淋巴细胞克隆产生的 多种抗体的混合物 。
（3）反复冻融法

原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞 内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后 置室温融化，如此反复两次，大部分组织细 胞及细胞内的颗粒可被融破。


特点：此法适用于组织细胞。
（4）表面活性剂处理法
原理：
在适当的温度、pH及低离子强度的条件下， 表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透 性改变或使之溶解。 应用: ①破碎细菌，且作用比较温和 ②提取核酸时，常用此法破碎细胞
白蛋白 IgM IgG
Sephadex G-200凝胶
4. 离子交换层析法
原理：
利用带电离子基团的纤维素或凝胶，吸
附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋 白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤
维素结合的能力有差别。
交联葡萄糖 琼脂糖 聚丙烯酰胺
离子交换 纤维素
常用离子 交换剂
离子化 细粉
交联树脂
抗体/致敏淋巴细胞
1、载体的选择
①蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、 兔血 清白蛋白、牛甲状腺球蛋白
②多肽聚合物：多聚赖氨酸 ③大分子聚合物：
羧甲基纤维素
聚乙烯吡咯烷酮
2、半抗原与载体的连接方法
①物理方法 ②化学方法
碳化二亚胺法：
半抗原＋载体 蛋白质 混合 R搅拌1-2h 室温24h
人工免疫原
2. 离子交换层析法
常用的离子交换剂有DEAE纤维素或 QAE纤维素。此法获得的IgG较纯，不含 其它杂蛋白。
3. 亲和层析法 装柱 上样 结合 洗脱
Sephadex G25-SPA
（二）特异性抗体的纯化
单价特异性：指抗血清只与其特异性 抗原发生反应。
有时免疫原不纯，含有微量的杂抗原， 制备出的抗血清中出现2-3种杂抗体。
解脱剂：
3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、 0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液
★（三）免疫球蛋白片段的制备：
1. 解离二硫键
2. 溴化氰裂解法
3. 酶裂解法
三、半抗原
半抗原（无免疫原性）多肽、多糖、甾族激 素、脂肪胺、类脂质、 ＋ 核苷、某些药物以及 其他化学物品等。 载体
完全抗原（具免疫原性） 机体
NH=CH-R’ 透析除去未反应 的半抗原
戊二醛法:
半抗原-NH2 混合
OHC-(CH2)3-CHO
载体蛋白NH2
半抗原-N=CH(CH2)3-CH=NH-载 体蛋白
☆戊二醛是常用的带有两个活性基团的 双功能联接剂☆
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）： 预先或与抗原同时注入体内，可 增强机体对该抗原的免疫应答或改 变免疫应答的类型的物质称为免疫 佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
五、抗血清的鉴定和保存
抗原的制备 抗原的分离纯化 纯化抗原的鉴定 佐剂 免疫动物
制备抗血清
抗血清的鉴定、保存
五、抗血清的鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定
抗体特异性的鉴定
抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
1.抗体效价和纯度的测定
颗粒性抗原：凝集反应
抗血清1:8 1:16 1:32 1:64
可溶性抗原：沉淀反应
1.动物体内诱生法
2.体外细胞培养法
3.兔单克隆抗体
四、单克隆抗体纯化 五、单克隆抗体鉴定
六、单克隆抗体的特性 1.高度特异性 2.高度均一性 3.弱凝集反应和不呈现沉淀反应 4.细胞毒作用较弱 5.对环境敏感性
七、单克隆抗体的应用 1.临床检验诊断试剂 2.蛋白质的纯化 3.肿瘤的导向治疗 4.放射免疫显像技术
所用材料必须是新鲜或低温保存的 洗去血迹 及污物 脏器进行灌洗
NS内含0.5g／L NaN3
去除包 膜或结 缔组织
冷浴中组织剪碎
上清液 澄清
装入捣碎机筒内高速 粉碎制成组织匀浆液
3000r／ min×10min
去除细胞碎片 及微小组织
离心
取上清液
2.细胞可溶性抗原的破碎 （1） 超声破碎法 （2）酶处理法 （3）反复冻融法 （4）表面活性剂处理法
多克隆抗体的产生示意图
一、免疫动物的选择
抗原来源与动物种属的 关系：种属差异越远，
免疫原性越强；
健康、体重符合要求；
动物个体的选择：适龄、
抗原的性质；
二、抗原剂量的选择
最常用的纯化方式是提取抗血清中的 特异性IgG或单价抗体。
三、免疫程序
免疫原的剂量
免疫间隔时间
免疫途径
四、采血方法
颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 心脏采血法：家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法：家兔、山羊、绵羊 眼球摘除法或断尾法：小鼠
克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体，
其混合物为多克隆抗体。
特异性IgG抗体的纯化方法有盐析法、凝胶 过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等；制
备单价特异性抗血清可采用亲和层析法和吸附
剂方法。
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