植物系统学研究中常用基因分子标记特点分析

植物系统学研究中常用基因分子标记特点分析史全良　吴均章(苏州大学水产学院生物系江苏苏州215151)

摘要　阐述了目前常用于植物系统学和进化研究的一些常用的DNA分子标记技术,分析了各自的使用范围和应用特点,提出在使用这些分子标记来研究分子系统学时必须注意的问题。

关键词　植物系统学　进化　分子标记

过去研究植物系统分类和演化的方法是在群体的整体水平上,以物种的形态特征特别是生殖系统的形态特征及繁殖方式、代谢物种类,结合古生物学、植物地理学、统计学等进行研究。随着现代生物技术迅速发展,80年代开始利用DNA分子标记技术研究植物系统学,形成了植物学研究的一个新的热点——植物分子系统学。现就目前国内外常用的基因标记种类及各自的特点做简要介绍。

1　RAPD标记

由W illiam s等首先于1990年用随机核苷酸序列作引物扩增基因组DNA以来,由于引物的随机性、对模板DNA要求较低、操作相对简便和多态性高等,RA PD(R andom Am p lified Po lym o rp h is m ic DNA)技术在植物系统学研究中已广泛地被使用。

随着RA PD技术的广泛应用,其局限性也相继被发现。T ho rm ann等(1994年)在十字花科植物的研究中,比较了R FL P和RA PD标记分别在种内和种间得出的结果,发现R FL P和RA PD标记在种内水平的结果完全吻合,但在种以上等级的结果相差甚远。他们将RA PD产物标记作探针,杂交结果表明,与探针片段迁移率一致的带有时并不同源,这种情况仅发生在种间。Sm ith等(1994年)在单胞杆菌的研究中也得出这一结论,并发现由于引物的竞争等,基因组中RA PD位点有时不能全部检测出,造成差异假象。汪小全等(1996年)探讨了RA PD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题,认为RA PD方法可以应用于种间乃至边缘属之间亲缘关系的研究,但有一定的局限性。因不同种或属的扩增产物难以作其同源性分析,只能作表征分析,从而只能从相似性或遗传距离上分析亲缘关系,其结果可能与真实的系统关系相左。此外还因RA PD在种间或属的变异水平很高,取样代表性是一个值得重视的问题,即用1个个体代表1个种或用1个种代表1个属都可能造成结果的极大偏差。RA PD标记的这些特点大大限制了在较高分类阶元等级的应用。

2　ITS序列分析

核rDNA的内转录间隔区(In ternal T ran2 scribed Sp acer IT S)包含被5.8s rDNA所分隔的IT S1和IT S2两个片段

。如图1。

图1　植物18s～26s r D NA的基本结构

在被子植物中IT S1的长度为187～298bp,IT S2为187～252bp。张文驹等(1998年)对4个供体的普通小麦基因组的IT S1和IT S2及IT S序列分析,得出了唯一的最大简约树,三者拥有相同的分支结构,因此有些作者仅用IT S1或IT S2就能得到合理的结果。IT S序列变异较快,可以提供较丰富的遗传信息,已证实它是研究许多被子植物类群系统与进化的重要分子标记,不仅可以解决科、亚科、族、属、组内的系统发育和分类问题,而且可用于重建多倍体复合体的网状进化关系,探讨异源多倍体的起源过程。IT S之所以成为被子植物系统与进化研究中的重要分子标记,主要基于以下两个方面原因:第一,作为18s～26s rDNA的一个组成部分,IT S在核基因组中是高度重复的,

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—生　物　学　通　报 2000年第35卷第12期

在被子植物中的拷贝数可达成1000～10000个,而且通过不等交换和基因转换,这些重复单位间已发生了位点内或位点间的同步进化,即不同IT S拷贝间的序列趋于相近或完全一致,这就为对PCR扩增产物直接测序奠定了基础;第二,被子植物的IT S区段长度较裸子植物相比比较稳定,为测序带来了方便,同时,18s、5.8s、26s rDNA的序列非常保守,有利于通用引物的设计,目前研究中所用的引物是W h ite 等(1990年)在真菌系统学研究中设计的引物,也有作者采用调整后的引物。关系密切的物种间IT S长度接近,而序列有一定程度的变异,因此该片段特别适合于属、组级的系统发育和分类研究。

IT S序列分析目前已经成为被子植物系统学研究的重要手段。在小麦、大豆等许多农作物和花卉树木的系统研究中取得了巨大的成果,验证或重新确定了它们的分类地位和演化关系。

由于同步进化的原因,IT S序列在许多物种内不存在变异,因而一般不适用于种内分类水平上的研究。

3　18s r D NA序列分析

18s rDNA序列分析是另一种重要的研究手段。Chaw等(1997年)运用18s rDNA序列探讨了裸子植物的分子系统发育及种子植物的进化问题,结论支持裸子植物为单系群。So ltis 等(1997年)选用了233个种代表被子植物的所有亚纲,用18s rDNA序列研究支持了木兰亚纲是现在被子植物中最原始的类群。在研究中他们还发现,18s rDNA序列中的插入和缺失并不频繁,在高度保守区发生的几个插入和缺失事件均有系统学意义,说明18s rDNA序列分析对揭示被子植物中高等级分类群间的系统发育关系具有重要意义。

4　叶绿体基因组

高等植物中,细胞器基因包括叶绿体基因组(cpDNA)和线粒体基因组(m tDNA)。由于植物线粒体基因组重排事件频繁,很难用于分子系统学研究。而植物的叶绿体基因组相对比较保守,很多叶绿体基因已被用于分子系统学研究。

已知的叶绿体基因组大小为71～217kb,但绝大部分叶绿体基因组的大小为120～160kb。目前已有水稻、玉米、黑松等6种植物的cpDNA完成了全序列测定,适用于系统学研究的叶绿体基因有rbc L(R uB isco大亚基编码基因)、m atk(tRNA成熟酶编码基因)、ndh (脱氢酶编码基因)、trn内含子(tRNA编码基因间隔区)等20种以上。

4.1　rcbL基因　目前用于远缘间及科级以上分类群的研究绝大多数利用叶绿体基因中的rbc L基因。该基因既可用其限制性内切酶位点多态性,也用其核基因核苷酸序列变异分析来研究系统学。Chase等(1993年)研究了499种种子植物,代表了绝大部分种子植物科,构建的分类图为利用分子或非分子性状进行系统发育研究提供了一个十分有用的框架。如俸宇星等(1998年)利用rbc L基因序列分析对连香树科和交让木科的系统位置进行了重新评价。陈之瑞等(1998年)用rbc L基因核苷酸序列确定了马尾树科的系统位置。

4.2　m atK基因　该基因编码一种成熟酶,位于trnK基因的内含子中,长约1500个碱基,参与RNA转录中 型内含子的剪切(见图2)。

图2　m taK基因位置示意图及扩增引物

到目前为止,该基因被认为在叶绿体基因组中的所有编码蛋白基因中进化速率最快。在被子植物科内水平的近缘关系研究中已被使用。John son&So ltis(1995年)研究得出m atK 的序列变异中转换和颠换的频率、密码子3个位置的变异频率没有严重的偏离。由于m atK 序列的变异较为均一,在构建系统树时不必对不同类型的变异进行加权,极大地增强了分子系统树的可靠性。

4.3　trn基因　trn基因内三段非编码区,由于不受功能的限制,其进化速率大于功能编码区,目前已被广泛用于植物系统学研究。

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2000年第35卷第12期 生　物　学　通　报