生殖医学与遗传咨询

染色体微阵列芯片的临床应用

染色体微阵列芯片（CMAs）于2007年和2011年已经在指南里出现，并认为 在发育迟缓、自闭症、和多发性畸形的诊断中可以替代染色体核型分析 在人类生殖领域，CMAs2004年开始用于流产绒毛染色体分析，和2005年胎 儿畸形诊断，并于2010年取代了FISH用于PGS。 2009年开始CMAs被推荐在妊娠期可疑胎儿畸形但染色体核型正常，或染色 体核型无法获得时，作为联合诊断的工具应用。 目标CMAs被推荐用于与临床有关联，或不确定关联的非重叠CVN区域的检 测。


Fan HC, et al. Nature 2012, 487:320-324. Chen S, et al. Genome Medicine, 2013.
PGD/PGS的活检的材料

活检取材的样本能否代表胚胎的遗传物质？ 活检取样操作本身对胚胎发育潜能的影响？
极体活检
卵裂期活检
囊胚期活检
coincide inconsistent inconsistent coincide coincide inconsistent
南京医科大学第一附属医院生殖中心，2014
实验囊胚样品芯片和测序结果比对
样品编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 芯片结果（MDA扩增） 46，XX 46，XX 46，XX 46，XY 46，XY 46，XY 46,XY,-12(pterq13.11),+20(pter-q11.22) 测序结果（MDA扩增） 46，XX 46，XX 46，XX 46，XY 46，XY 46，XY 46,XY,-12(pter-q13.12),+20 (pter-q11.23) 46,XY,-5(q35.1-qter),+8(q13.1qter),+13 46,XY,+15(q11.1-q15.1),22(q11.1-q12.3) 比对结果 coincide coincide coincide coincide coincide coincide coincide
序贯活检（PB1、PB2、卵裂球、囊胚活检）
SNP单体型分析
--Scott RT, et al. Fertil Steril, 2013
用PB1、PB2进行PGD的原理
两次减数分裂的类型

姐妹染色单体过早分离 （Premature Separation of Sister Chromatids ，PSSC） 分裂后期迟滞，丢失一条 染色体，恢复二体性； 单体细胞通过染色体自我 复制，恢复二体性。SNP array囊胚活检筛查UPD约 0.06%， 结果不支持非整 倍体的自我修复机制。
Angell RR. Hum Genet, 1991 Pellestor F et al. Hum Genet, 2003 Gabriel AS, et al. J Med Genet, 2011 Magli MC, et al. RBM online, 2012 Gueye NA, et al. Fertil Steril, 2013
人类生殖过程的遗传学检测阶段
Umbilical vein puncture
Amniocentesis
Chorion villus sampling
概要


胚胎植入前诊断PGD
PGD的基本原理适应症 用于染色体疾病PGD的基本技术和现代技术 PGD的取材 单基因PGD技术的临床应用

5q35.1-qter del 9.7M
11q12.2-qter dup 74.5M
Array CGH的PGD应用实例
Chr. 10
Chr. 7
46,XX,t(7;10)(p22;q22)
Array CGH的PGD应用实例 46,XX,t(7;10)(p22;q22)
Leabharlann Baidu7p21.2-pter dup 15M


滋养外胚层细胞是否代表内细胞团？
假说：异常细胞倾向于向滋养外胚层迁移

TE和ICM染色体组检测比较

方法：51个优质囊胚，分离为ICM和TE，部分囊胚的TE被分离TE1 和TE2。SNP array 分析染色体非整倍性。 结果 : 41个整倍体胚胎的TE和ICM结果一致; 10个非整倍体胚胎中2个 （3.9%）TE和ICM结果不同，提示嵌合体。 结论：TE活检可以反映内细胞团（ICM）的染色体组成



Array CGH技术在PGD中优势

样本预处理简单 全面分析染色体组 分辨率高 统一方法 结果伴读自动化，客观


Array CGH的PGD应用实例
Chr. 11
Chr. 5
46，XY，t(5;11)(q35;q11)
Array CGH的PGD应用实例
46，XY，t(5;11)(q35;q11)
生殖医学与遗传咨询
江苏省人民医院/南京医科大学第一附属医院 生殖医学国家重点实验室 刘嘉茵
不良生殖结局
(Adverse Reproductive Outcomes)
不良生殖结局的致病因素
不良生殖结局的母体相关危险因素
出生缺陷和生殖障碍问题面临的挑战

多个致病或易感基因和环境交互作用导致的结构和功能的异常 发生机制复杂，人种间有差异 常规的分子生物学手段无法检测和筛查 研究单一、分散而缺乏系统，基础和临床研究脱节 对缺陷儿缺少进一步的随访和康复体系
10q21.2-qter del 70.9M
Array CGH-PGD的临床结局
项目 取卵周期数 女方平均年龄（岁） 活检胚胎数（枚） 平均活检胚胎数（枚/取卵周期） 明确诊断胚胎数（%） 染色体正常胚胎数（%） 无可移植性胚胎周期数（%） 平均移植胚胎数（枚/移植周期） 移植周期数 新鲜移植周期数 冻胚移植周期数 临床持续妊娠数（%） 新鲜周期持续妊娠数（%） 冷冻周期持续妊娠数（%） 58 29.6±3.9 352 6.1 98.3%（346/352） 20.2%（70/346） 27.6%（16/58） 1.0 51 31 20 41.2%（21/51） 38.7%（12/31） 45.0%（9/20） 相互平衡易位 32 29.7±4.0 176 5.5 97.7%（172/176） 30.8%（53/172） 28.1%（9/32） 1.0 28 2 26 57.1%（16/28） 0（ 0） 61.5%（16/26） 罗氏易位 90 29.7±3.9 528 5.9 98.1%（518/528） 23.7%（123/518） 27.8%（25/90） 1.0 79 33 46 46.8%（37/79） 36.4%（12/33） 54.3%（25/46） 总计
注：数据来源于本中心2011年7月—2013年11月，活检胚胎≥4枚病例总结
新一代测序技术（NGS）临床应用

2G NGS 技术已经用于单细胞的染色体组和单基因的检测。 3G NGS 技术满足：更少的模板DNA，更长的测序片段，更好的精 确度，更快的运行时间，更低的成本， 更保真的全景
Array – CGH 和 二代测序核型分析比对示例
46,XY,t(1;12)
本中心FISH/PGD染色体异常种类

性染色体数目异常（47,XXY; 47,XXX;47,XYY)； 罗伯逊易位（45,XY,r(13,14); 45,XY,r(12,14)）； 染色体平衡易位（46,XY,t(1,12);46,XX,t(12,14)); 染色体臂间倒位（46,XY,inv(9); 46,XY,inv(6))； Y染色体DAZ基因缺失； 染色体非整倍体(47, XY,+21）; X-连锁遗传性疾病
normal 11 normal 22
der 22
der 11
Metaphase chromosomes
blastomere
rob(13;14)(q10;q10)
normal 13
normal 14
der 13-14
Metaphase chromosomes
blastomere
染色体平衡易位FISH / PGD
胚胎植入前遗传学筛查PGS 男科不育的遗传学临床咨询 复发性流产的遗传学检测 现代遗传学技术在生殖医学领域的成果
胚胎植入前遗传学诊断/筛查
Pre-implantation Genetic Diagnosis/Screening ( PGD/PGS )
对有遗传性缺陷高风险的夫妇，通过体外受精（In Vitro Fertilization, IVF）程序，应用分子、细胞遗传学技术在体外选择正 常胚胎植入，亦称为孕前诊断。
S8
47,XY,+8(q13.3-qter),+13
coincide
S9
46,XY,+15(q11-q13.1),22(q11.1-q11.21)
coincide
南京医科大学第一附属医院生殖中心，2014
二代测序无创产前诊断技术

无创产前（NIPD）诊断技术已广泛应用母亲外周血游离胎儿 DNA(cffDNA)进行非整倍体的筛查（>6%）。 2010首次提出二代测序技术用于胎儿DNA全基因组检测。 2012年Chen et al 的方法能够富集100%胎儿等位基因，一步获得胎儿 全基因组和倍体，并且进一步分析得到重组位点信息。 这一技术进步可以对诊断胎儿孟德尔遗传疾病、筛查复杂性疾病、鉴 别新发的拷贝数异常、包括微缺失和微重复的异常，有重大的推动。
胚胎植入前遗传学诊断
卵裂求活检进行遗传学检测
1
2
3
4
5
异常胚胎
异常胚胎
异常胚胎
移植信号正常的胚胎
PGD的适应症

染色体异常：平衡易位，罗氏易位等 单基因疾病：常显、常隐、X连锁 易感基因的剔除：乳腺癌等 HLA配型
染色体平衡易位PGD/FISH探针选择
t(11;22)(q25;q12)
出生缺陷防控和干预：知识瓶颈，技术瓶颈，体制瓶颈
生殖障碍的遗传学研究领域

男性和女性的生殖健康筛查 配子生成和发育异常 性腺发育和激素 男女性不孕不育症 排卵障碍（PCOS和POI） 盆腔子宫内膜异位症 卵巢反应预测 卵巢刺激的个体化方案 遗传疾病的植入前诊断和筛查 复发性流产


Embryo 29 22 51
ICM 29 22 51
TE 58 22 80
---Johnson DS，et al. MHR，2010
卵裂期和囊胚期活检对临床结局的影响

配对随机研究 <35岁女性，正常的卵巢储备（ day3 FSH <12 U/L，基础窦前卵 泡≥12）； 男方精液>100,000运动型精子， ≥1%的正常形态精子 卵裂期活检组(n=46) 囊胚活检组(n=70) SNP array: 进行SNP分型示踪 提示：卵裂期活检，胚胎种植率 相对降低39%，而囊胚活检无明 显影响。
↓ ↓
↓
↓
karyotype：XX chr19 {q13.33->q13.43(9.19Mb)}
chr7 {q31.32->q36.3(35.91Mb)}
-chr20 {p13->p12.3(6.98Mb)}
南京医科大学第一附属医院生殖中心，2014
二代测序用于染色体PGD
MPS数字图像 用二代测序技术和SNParray比 较了16对夫妇38枚和14对染色 体异常夫妇的29枚囊胚滋养层 活检细胞核型。 测序方法对平衡易位的检出精 确度更高，但是需要时间和胚 胎冷冻。
SNP array
Yin XY et al，BIOLOGY OF REPRODUCTION，2013
二代测序的单卵裂球和滋养细胞的实验结果
样品例数/ 编号
18 例 1 1 8 1 1 30
样品类型
BLASTOME RE BLASTOME RE BLASTOME RE TE TE TE BM / TE
测序结果（sureplex扩增）
Balanced, Euploid +(Xq26.3-q27.3) +(18q12.3-q23) Balanced, Euploid +(7q31.31-qter),+(19q13.33qter);-(20p12.3-pter) +(1p21.1-p21.1)
比对结果
芯片结果（sureplex扩增）
Balanced, Euploid Balanced, Euploid -(6p25.2-pter);+(18q12.3qter) Balanced, Euploid +(7q31.31-qter),+(19q13.33qter);-(20p12.3-pter) Balanced, Euploid