生物工程综合实验

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生物工程综合实验
实验名称：制备固定化酵母蔗糖酶的工艺流程研究
1、酵母培养基的优化研究
2、酵母适宜的细胞壁破壁方法的研究本实验共分以下几个部分完成：
3、酵母蔗糖酶的分离、纯化工艺研究
4、酵母蔗糖酶的固定化工艺研究
5、酵母蔗糖酶固定化前后的性质研究本实验的具体日程安排
周一：查阅资料(要记录参考的文献作者、出处、年献等)
1、利用已有的培养基组分葡萄糖、蔗糖、酵母膏、KH2PO4作为实验
考察的因素，设计正交实验方案进行培养基配方的优化选择；
2、
实验一酵母的培养基优化研究
一．实验目的：
1、通过实验，掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法。

2、筛选微生物最适生长及产物形成的营养条件和培养条件，学会利用正交实验设计方法确定特定产物发酵的工艺参数。

二．实验原理
培养基的组分、配比、培养条件随着不同发酵微生物的生长需要、产物合成需要等不同而不同，目前还不能从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方。

只能参照前人所使用的较适合于某一类菌种的经验配方。

为了加快试验时间，可考虑利用“正交试验设计”等数学方法来确定培养基组分、培养条件等。

本实验以酵母培养一定时间后，生物量的大小来评定适宜的培养基组分组合，由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。

三．仪器与试剂
全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、三角瓶、棉塞、电炉。

试剂为葡萄糖、蔗糖、酵母膏、KH2PO4、市售安琪酵母。

四．实验方法(1)、培养基的配制(见表1,2)
表1 正交表试验设计
因素水平葡萄糖蔗糖酵母膏KH2PO4
1
2
3
表2 正交表实验方案
编号葡萄糖(A) 蔗糖 (B) 酵母膏(C) KH2PO4（D）生物量（OD）
24h
1 (1) (1) (1) (1)
2 (1) (2) (2) (2)
3 (1) (3) (3) (3)
4 (2) (1) (2) (3)
5 (2) (2) (3) (1)
6 (2) (3) (1) (2)
7 (3) (1) (3) (2)
8 (3) (2) (1) (3)
9 (3) (3) (2) (1)
（2）将上述培养基配制好以后，每250 ml三角瓶装入培养基100 ml，
于121℃下灭菌20 min，冷却；
（3）酵母菌悬液的制备：取市售酵母酵母装入灭过菌的盛有无菌玻璃珠的三角瓶中，加入无菌水，震荡5分钟后，备用接种；
（4）培养基冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养；（5）测OD值：将接种24 -36 h的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm 比色皿中测定0D值。

比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成。

五、结果：
要求画出各个营养因素对酵母生物量的影响趋势图、列出各个营养因素对酵母生物量的影响次序、最优的营养配方的组合是哪个及其确定过程？：
实验二酵母适宜的细胞壁破壁方法的研究
一、实验目的：
1、掌握非机械方法破碎细胞的工艺流程；
2、学习利用单因素等实验方法确定适宜的微生物细胞破碎条件的流程。

二、实验原理：
微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，但是还有许多是存在于细胞内部。

就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，本实验预提取的蔗糖酶系胞内酶。

提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。

本实验利用反复冻融法和有机溶剂处理法来破坏酵母的细胞壁。

反复冻融法利用细胞放在低温下濡染冷冻和室温等条件下融化，反复多次而达到破壁作用，由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。

采用有机溶剂法如十二烷基硫酸钠等，可使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。

三、药品及试剂
水浴锅、冰箱、烧杯、0.3 mmol/L的十二烷基硫酸钠、显微镜、血球计数板。

四、实验步骤
1、SDS法破碎酵母细胞壁：取酵母培养液，加入一定量的0.3 mmol/L的十二烷基硫酸钠，在40℃下水浴12h后取出，在显微镜下观察破壁的结果。

需考察的因素为：SDS的溶液量（参考值：40 ml、60 ml、80ml、100ml）。

2、反复冻融法破碎酵母细胞壁：取酵母培养液，放置在不同的温差下，经过30分钟，在显微镜下观察破壁效果。

需考察的因素为：温差（参考值：40℃、60℃、80℃）。

五、结果：列出不同的破壁方法下细胞破碎的程度及趋势图。

实验三酵母蔗糖酶的分离提取
一、实验目的：
（1）通过本实验学习并掌握蛋白质和酶的基本研究过程；
（2）掌握生物大分子的分离、提取方法。

二、实验原理
蔗糖酶又称转化酶，1828年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在。

蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。

按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖β-D-呋喃果糖苷酶和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶。

前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中，工业上多从酵母中提取。

酵母蔗糖酶系胞内酶，提取时细胞破碎或菌体自溶。

本实验利用机械研磨法破碎酵母，并进行蔗糖酶的分离提取，并测定提取的酶液的酶活，评定分离提取的效果及后期的固定化酶活的变化程度。

三、药品及仪器
酵母、海沙、冰浴、甲苯、研钵、胶头滴管、量筒、水浴锅、广泛pH 试纸、离心机、50ml离心管。

四、操作步骤
1.提取
(1) 将研钵、海沙、甲苯、去离子水放入冰箱的冷冻层中进行预冷。

将酵母培养液离心分离（4000rpm）5-10min，取下层沉淀物。

(2)将收集到的沉淀物和10g海砂放入研钵中。

量取预冷的甲苯10ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需40分钟。

(3)缓慢加入预冷的30ml去离子水，每次加5ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。

以便将蔗糖酶充分转入水相。

(4)将混合物转入两个离心管中，平衡后，用离心机离心，4000rpm，10min。

离心完毕后可以看到离心管内分层如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。

用滴管吸出上层有机相。

(5)用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4000rpm，离心10min。

(6)将清液转入量筒，量出体积，之后转入清洁离心管中。

(7)用pH试纸检查清液pH，用醋酸将pH调至5.0，称为"粗级分I"。

2. 热处理
(1)预先将恒温水浴调到45℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。

(2)取出离心管，于冰箱冷冻层中迅速冷却，用4000rpm，离心10min。

(3)将上清液转入量筒，量出体积，留出2ml测定酶活(称为"热级分II")，热级分II冰箱冷藏层保存，用于下一步的酶固定化实验中使用。

(4)测定提取粗酶制剂的酶活，测定方法同蔗糖酶酶学性质的研究实验中
五、结果：
写本次实验报告之前，预习内容，查阅有关酶或细胞固定化的方法及原理
实验四、酵母蔗糖酶的固定化
一、实验目的
学习固定化酵母蔗糖酶的原理与方法；掌握固定化酶的制作工艺流程二、实验原理
固定化酶又称为固相酶，是通过物理及化学的处理方法，使水溶性酶和固态的水不溶性支持物（或载体）相结合而制备的。

通过酶的固定化可以将酶转变成不溶物同时仍保留酶的活力，在催化反应中具有诸多水溶性酶所不具备的优点。

相对于水溶性酶，固定化酶的优点主要是机械强度增加，稳定性提高，可回收反复使用。

常用的酶固定化方法主要有：物理吸附法；载体偶联法；交联法；包埋法等。

包埋法是固定化的一种常见方法，条件温和、操作简单、对酶活影响小，有利于小分子量底物的进入和小分子量产物的扩散，适合固定化。

本实验利用海藻酸钠包埋法对酵母中提取出来的蔗糖酶进行固定化，海藻酸钠是应用最广泛的水溶性海藻酸盐。

海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶。

利用这种性质，将海藻酸盐溶液滴入含有钙离子的水溶液中可产生海藻酸钙胶球，胶球具有热不可逆性，不受温度影响，可进行加热灭菌和微波炉等处理，是良好的固定化包埋剂。

三、药品、器材
水浴锅、移液管、三角瓶、烧杯、电炉、刻度试管、玻璃棒、分光光度计、海藻酸钠、氯化钙、戊二醛
四、操作步骤
1、固定化蔗糖酶的制备
(1)将上清液与1%的海藻酸钠(1g海藻酸钠加入100ml水中，微火加热溶解后冷却到室温)溶液混合均匀，用胶头滴管缓慢的滴入5%的CaCl2溶液100ml中，制成2~3mm的球形固定化酶，固定一小时；之后用水洗净，再用1%的戊二醛溶液30ml交联30min，洗净后用35℃烘干、备用。

(2)检验凝胶珠的质量是否合格，可以采用以下方法。

一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。

二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。

写本实验之前，请查阅资料关于酶固定化前后有哪些性质改变及原因实验五、酵母蔗糖酶固定化前后的活力的比较
一、实验目的
掌握蔗糖酶活力的测定原理及还原糖的定量检测法；了解蔗糖酶固定化前后酶活的变化情况。

二、实验原理
酶在水溶液中以自由的游离状态存在，但是固定后酶分子便从游离的状态变为牢固地结合于载体的状态，其结果往往引起酶的性质的改变。

为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别，并对操作条件加以适当调整。

酶在固定化前后性质的变化表现在活力、稳定性、反应特性上等。

本实验主要从酶固定化前后的活力进行比较，以及综合前一个实验的固定化酶的凝胶珠机械性能检验，评价酶固定化的优劣。

从酵母中提取的蔗糖酶活力的测定原理如下：
DNS法是利用3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后，被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度呈一定比例关系这一原理而设计的，可用于比色测定。

操作简便、快速、杂质干扰较少。

三、药品和器材
水浴锅、分光光度计、比色管、移液管、葡萄糖、10%蔗糖溶液、DNS 试剂
四、操作步骤
（1）葡萄糖的标准曲线制作
葡萄糖标准溶液的配制：准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，再定容到刻度，摇匀，浓度为1mg/mL。

取六支试管，分别按表1中所示过程方法试剂。

将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向各试管中加入21.5mL蒸馏水，摇匀。

于520nm波长处测定A值，并将测得的A值列于表一中。

以吸光度为纵坐标、糖的毫克数或浓度为横坐标，绘制标准曲线。

表1 试剂组成及A520值
加液量 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准溶液体积（mL）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
相当于葡萄糖含量（mg）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 去离子水（mL） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 3,5-二硝基水杨酸试剂（mL） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 吸光度A值
（2）游离酶反应液、固定化酶反应液中葡萄糖含量的测定
在三角瓶中加入1mo1/L蔗糖溶液1mL，pH 4.6的NaAc—HAc缓冲液2.0mL，蒸馏水 6.5 mL，混匀并在30℃恒温水浴中平衡预热2min~5 min 后，加入酶液1ml或固定化酶1克，迅速混匀并计时。

在30℃条件下反应10 min，取干燥试管，加入酶反应液(≤2mL，不足2ml用蒸馏水补足)，按照表2 中加液量加入蒸馏水及3,5一二硝基水杨酸，混匀后按照标准曲线的制作中的操作进行，最后在520nm波长下比色，测定出各管溶液的吸光度值。

（4）计算：以各样品的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，并比较
固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：
①酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；
②当酶与载体结合时，它的高级结构发生了变化，其构象的改
变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；
③酶被固定化后，虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空
间位阻的影响。

生物工程综合实验
实验二糖化酶的发酵和提取实验
本实验共分以下几个部分完成：
1、文献检索
2、糖化酶的提取及纯化工艺流程研究
3、不同发酵时间对糖化酶活性的影响研究
4、糖化酶的最适反应温度及热稳定性研究
5、糖化酶的最适反应pH值及pH值稳定性研究
1、文献检索
同综合实验一
2-5、糖化酶的提取纯化及其酶学性质研究
一、实验目的与要求
目的：
1、熟悉酶制剂的发酵过程；掌握酶制剂的超滤浓缩、盐析或有机溶剂沉淀法的原理与操作步骤。

2、通过实验对糖化酶的酶学性质进行研究，以便更充分的对糖化酶加以利用。

要求：
1、复习微生物学及实验过程、发酵工程、生物物质分离工程所学到的微生物培养的方法、生物物质提取过程，了解影响微生物生长、生物物质提取过程中各种影响因素。

2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。

3、6-7人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。

4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。

二、实验原理、内容
葡萄糖淀粉酶俗称糖化酶，是国内酶制剂中产量最大的酶制剂品种。

生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉，将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液，转接到三角瓶直接进行发酵。

黑曲霉糖化酶是一种胞外酶，当对其进行提纯分离时，可采用过滤法，将菌体等杂质除去，继而对滤液进行浓缩，最后将酶沉淀出来，对沉淀物进行干燥，加工成成品。

糖化酶的沉淀可采用硫酸氨盐析法，也可采用有机溶剂如乙醇沉淀。

本实验将对这两种沉淀方法进行比较。

黑曲霉发酵过程中不同发酵时间所产生的糖化酶的量及其活性不同，本实验将监测黑曲霉发酵24h，48h，72h内产酶量及其活性，以找出适宜的发酵时间。

糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范围是4～6, 温度范围是40～60℃）进行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。

以单位时间内分解α–１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。

糖化酶的酶活力定义是1克固体酶粉（或1ml液体酶），于55℃pH=4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以u/ml( u/g)表示。

碘与NaOH 作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与葡萄糖作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出未参与反应的NaIO ，由此推导出糖化酶催化所产生的葡萄糖的含量。

三、实验主要仪器设备及材料
恒温培养箱可控温摇床
所需材料；
菌种：黑曲霉UV-11
培养基：淀粉，葡萄糖，无机盐
四、实验方法、操作步骤
1、配制发酵摇瓶培养基：淀粉10 g；NaNO3 2 g；K2HPO4 1 g；KCl 0.5 g；MgSO4 7H2O 0.5 g；FeSO4 7H2O 0.01 g；·蒸馏水1 000 mL,自然pH.
2、发酵摇瓶培养：把发酵摇瓶培养基装入250 mL 三角瓶中,装液量为80 mL.按5%接种量把半干体培养基接种于发酵摇瓶培养基中,于33℃下恒温摇床培养,转速为210 r/min.
3、发酵过程监控：每隔24小时取样测定酶活、pH、还原糖浓度。

（1）糖化酶提纯方法：取发酵液 4 000 r/min 离心15 min 去菌体,所得上清液为粗酶液。

将粗酶液浓缩到1/3,将浓缩液均分为二，一份进行有机溶剂沉淀，一份进行无机盐沉淀
a有机溶剂沉淀
将浓缩液用盐酸调节pH至3.5。

在10-20℃条件下加入3.5倍冷冻的无水酒精，边加搅拌，即可发现酶的沉淀现象。

沉淀物用布氏漏斗抽滤。

称酶泥的重量，测定酶活。

b无机盐沉淀
向浓缩液中按55g/100ml的量加人硫酸铵，静止盐析1h。

沉淀物用布氏漏斗抽滤。

称酶泥的重量，测定酶活。

(2)酶活测定方法
待测酶液的制备：称取酶粉1-2克，精确至0.0002克（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。

沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100-250u/ml范围内），摇匀。

通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

测定：于甲、乙两只50ml比色管中，分别加入可溶性淀粉25ml 及缓冲液5ml，摇匀后，于55℃恒温水浴中预热5min。

在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入5mol/L氢氧化钠溶液0.2ml,摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml。

吸取上述反应液与空白液各5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加0.1ml/L氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密闭于暗处反应15min.取出，加硫酸溶液2ml,立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。

计算：
U=((A-B)c*90.05*32.2/5)*1/2*n*2=579.9*(A-B)c*n
式中U-样品的酶活力，u/ml或u/g；
A—空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积，ml；
B—样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积，ml；
c—硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；
90.05-—与1ml 硫代硫酸钠标准溶液（1mol/L）相当的以克表示葡萄糖的质量；
32.2—反应液的总体积，ml；
5—吸取反应液的体积，ml；
1/2—吸取酶液2ml，换算为1ml；
n—稀释倍数；
2—反应30min，换算成1h的酶活力系数所得的结果表
示至整数。

（3）酶的最适反应温度及热稳定性研究
将提纯的酶液分别置于40、50、60、70度下，测定酶的活力。

并以相对酶活（相对酶活规定方法：在一定温度下所测最高酶活,其相对酶活为100%）作纵坐标，温度做横坐标，绘制相对酶活随温度变化曲线。

把经分离纯化的糖化酶分别在30~60℃下保温 2 h,然后测定其残留酶活,即为糖化酶在此温度下稳定性
（4）糖化酶的最适反应pH值及pH值稳定性研究
考察在pH 值范围为 3.5~7.5 的经分离纯化的糖化酶的最适反应pH 值。

并以相对酶活（相对酶活规定方法：在一定温度下所测最高酶活,其相对酶活为100%）作纵坐标，pH 值做横坐标，绘制相对酶活随pH 值变化曲线。

五、实验分析项目和方法
1、比较用有机溶剂沉淀法及盐析法所得糖化酶活性高低
2、监测黑曲霉发酵24h，48h，72h内产糖化酶量及其活性
3、绘制相对酶活随温度变化曲线并分析其变化趋势，找出最适温度
4、绘制相对酶活随pH 值变化曲线并分析其变化趋势，找出最适pH 值
六、试验报告记载要求
1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间
2、实验的设计方案、所用的仪器名称、药品名称及重量；所使用的样品名称、来源
3、试验操作步骤记载
4、实验条件记载（温度、浓度、仪器条件等）
5、实验分析
6、实验中应注意的问题
7、实验收获。