间接免疫荧光法实验操作常见问题

• 用PBS-吐温缓冲液稀释病人标本。
• 因塑料制品会吸附抗体，造成抗体浓度的下降，所 以最好用玻璃管稀释样本。
间接免疫荧光法错误的避免 (3)
滴加样本至加样板的反应区：
• 加样量要准确。
• 避免产生气泡。
• 加完所有样本后方可开始温育。
间接免疫荧光法错误的避免 (4)
血清温育阶段：
• 确保液滴与生物薄片接触良好。
•
•
盖玻片表面有水滴。
显微镜有问题。
间接免疫荧光法问题的来源(2)
气泡：
• 封片不正确。 • 除去封片基质中的气体。
间接免疫荧光法问题的来源(3)
荧光强度减弱：
主要的原因：
•
• • •
显微镜调整的不合适。
本来应直接使用的血清又作了进一步的 稀释。 荧光素标记的二抗暴露在阳光直射处。 温育后的载片暴露在阳光直射处。
判断组织用的物镜有：20倍镜 判断细胞用的物镜有: 40倍镜
三、分析问题的来源
间接免疫荧光法问题的来源
当出现问题时，我们应该检查是否有：
• • • • • 图像不清 气泡 荧光强度减弱 组织有非特异反应 组织根本不反应
间接免疫荧光法问题的来源(1)
镜下图像不清
主要的原因：
• • • • • 封片基质过量。 盖玻片与载片吻合不好。 物镜的镜头模糊不清。 使用了两张盖玻片。 盖玻片表面模糊不清。
酶结合物1：10稀释(8)
正常操作
Hep-2细胞
猴肝
酶结合物1：10稀释：
结果可能会转阴
Hep-2细胞 猴肝
二抗加样量过多(9)
正常操作
Hep-2细胞
猴肝
二抗加样35ul：
Hep-2细胞
猴肝
荧光有增强， 结果不准确
二抗加样量少(10)
正常操作
Hep-2细胞
猴肝
二抗加样量为15ul： 荧光减弱， 结果不准确
间接免疫荧光法错误的避免 (8)
封片：
• 盖玻片上每反应区滴加PBS-甘油8ul，不要超过10ul。
• 立即检查盖玻片与载片是否吻合良好 ，必要时可调整盖玻片的位置。
有气泡存在时，需重新进行封片。
封片
间接免疫荧光法错误的避免(9)
结果判断：
• 将荧光显微镜放置在光线比较暗的房间。
• 使用合适的物镜和滤光片。
对照
细胞正常形态改变
过度干燥
Trocknung nach Konjugatschritt 载片过度干燥 BIOCHIP Mitte (20er) ( 酶结合物温育后 5分钟)
对照
细胞正常形态改变
过度干燥
载片保存不当(2) (温度或湿度过高)
对照 荧光素着色不均
温度或湿度过高
使用自来水配置PBS-吐温缓冲液(3)
Hep-2细胞 猴肝
37℃温育(11)
正常操作
Hep-2细胞
猴肝
37℃温育：
反应性增强，滴度升高
Hep-2细胞 猴肝
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清洗
间接免疫荧光法错误的避免 (6)
载片在第一次清洗后的处理：
• 不要擦拭反应区之间的间隙。
• 5秒钟内进行第二次温育。
载片的擦拭
间接免疫荧光法错误的避免(7)
荧光素标记的二抗（结合物）的使用：
• 荧光二抗直接使用。 • 不要将结合物放在阳光直射处。
• 加样量要准确。
• 从现在起，避免载片被阳光直射。
•
避免快速移动加样板。
•
避免缩短或延长温育时间。
•
常温进行温育。
间接免疫荧光法错误的避免(5)
清洗：
• 用PBS-吐温缓冲液流水迅速冲洗载片 (用大口杯，不要用细颈瓶)。
载破片垂直拿置，流水沿载破片上沿冲洗，避免水流直接冲洗基质面。
• 流水冲洗载片后立即放进盛有PBS-吐温缓冲液的洗杯中浸洗。 载片一定要浸洗。
间接免疫荧光法问题的来源(4)
组织有非特异性反应
显微镜镜检过程中生物薄片被淬灭
温育过程中有气泡
灰尘颗粒
组织折叠
间接免疫荧光法问题的来源(5)
组织切片没有任何反应
主要的原因：
• • 没有进行血清或二抗的温育。 缓冲液质量不好。
没有进行血清温育
没有进行二抗温育
间接免疫荧光法问题的来源(5)
实验准备阶段： • 用通常的家用洗涤剂和蒸馏水清洗加样板的反应区，用纸巾吸干。 • 只有当生物薄片载片平衡到室温后方可打开包装。 • 只能在手可触摸的区域作标记。
• 不要触摸生物薄片。
间接免疫荧光法工作台的布置
间接免疫荧光法错误的避免 (2)
样本稀释阶段：
• 在稀释前用旋涡混匀器混匀标本。
• 用可靠的去离子水配置PBS-吐温缓冲液。
部分组织没有任何反应
主要的原因：
• 基质被擦拭、挤压、掀盖导致基质破坏。
由刮或擦拭所引起的基质损坏
由于挤压所引起的基质损坏
由于掀盖玻片所引起的基质损坏
四、不符的操作对结果的影响
载片过度干燥（1) (血清温育后5分钟Hep-2细胞)
对照 细胞正常形态改变
过度干燥
载片过度干燥 (血清温育后5分钟猴肝)
猴肝
PBS吐温缓冲液 常温放置1周： 背景不干净,失去 清洗的作用
Hep-2细胞 猴肝
ຫໍສະໝຸດ Baidu
缓冲液配置只使用PBS(6)
正常操作
缓冲液配置只使用PBS： 背景不干净，1：100滴度结果变阴性
清洗时只冲洗不浸泡(7)
正常操作
Hep-2细胞
猴肝
清洗时只冲洗不浸泡： 荧光强度改变， 结果不准确
Hep-2细胞 猴肝
间接免疫荧光法实验操作常见问题
广东FAE
张嘉华
主要内容
1. 实验操作流程
2. 应避免的错误
3. 分析问题的来源
4. 不符操作对结果的影响
一、实验操作流程
间接免疫荧光法操作流程（1）
准备 样本稀释
30ul per field(5*5mm)
加样 血清温育 清洗
1 sec flush
正常操作
Hep-2细胞
猴肝
使用自来水配置 PBS-吐温缓冲液： 细胞不清晰，背景 不干净
Hep-2细胞
猴肝
使用蒸馏水清洗浸泡载片(4)
正常操作
Hep-2细胞
猴肝
使用蒸馏水清洗浸泡 载片： 细胞肿胀变形，滴度 下降
Hep-2细胞 猴肝
PBS-吐温缓冲液常温（25℃）放置1周(5)
正常操作
Hep-2细胞
5 min cuvette
间接免疫荧光法操作流程（2）
加荧光标记抗体 温育 清洗 封片 结果判断
25ul per field(5*5mm)
1 sec flush 5 min cuvette
10ul per field(5*5mm)
二、应避免的错误
间接免疫荧光法错误的避免 (1)