SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化

SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化

[适用对象] 生物工程专业

[实验学时] 8学时

一、实验目的

使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。

二、实验原理

质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒在基因工程中是最常用的载体。提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA 会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

三、仪器设备

培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－

20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。

四、相关知识点

本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。

多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。

五、实验步骤

细胞培养

接种培养

挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。

离心

取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

细胞的裂解

悬浮细菌沉淀

将细菌沉淀重悬于100μl预冷的碱裂解溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。（为确保细菌沉淀在碱裂解溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底互相接触同时涡旋振荡，可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率。）

裂解细菌悬液

加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

沉淀染色体和蛋白质

加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮

状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA 复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

沉淀多余的蛋白质

加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。小心移出上清于一新微量离心管中。

质粒DNA的回收

沉淀核酸

加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。

洗涤沉淀

1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

溶解质粒DNA

沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

质粒DNA电泳检测

制胶

用封边封住塑料托盘开放的两边，形成一个模具，置于一个水平支架上。加上梳子。称取琼脂糖0.5g，加0.5×TBE的电泳缓冲液100ml，用微波炉加热至琼脂糖熔化，待熔化的凝胶稍冷后加入溴化乙锭，使终浓度为0.5μg/ml。混匀凝胶。将凝胶浇灌到模具中。室温下30－40min。

上样电泳

向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。混合DNA样品

和0.2倍体积6×载样缓冲液，用微量移液器将其移至加样孔内。关上电泳槽盖，接好电极进行电泳。

紫外灯下观察电泳结果，记录。

六、实验报告要求

1、写明报告日期、地点、条件。

2、实验报告的目的和要求。

3、实验过程。

4、描绘实验结果。

5、分析结果并讨论。

6、回答思考题。

七、思考题

溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ中的主要试剂是什么？在质粒提取过程中分别起到了什么作用？

八、实验成绩评定办法

主要评分点：原理描述（10%）、实验流程（20％）、调试过程（10％）、数据记录（10％）、解决问题的能力（20％）、资料搜集（10％）、实验结果（10％）、实验效果（10％）等。